کنترل کیفیت آزمایشگاه بیوشیمی

​

​

مقدمه‌ای بر کنترل کیفیت آزمایشگاه بیوشیمی

کنترل کیفیت آزمایشگاه بیوشیمی فرآیندی اساسی است که دقت، صحت و قابلیت اطمینان آزمایش‌های بیوشیمیایی را تضمین می‌کند. این آزمایش‌ها نقش مهمی در تشخیص و پایش بیماری‌ها، هدایت تصمیمات درمانی و ارزیابی سلامت بیماران دارند. اجرای برنامه‌های قوی کنترل کیفیت، خطاها را به حداقل می‌رساند، کارایی آزمایشگاه را افزایش می‌دهد و انطباق با استانداردهای نظارتی را تضمین می‌کند.

اصول کنترل کیفیت در آزمایشگاه بیوشیمی بالینی

هدف اصلی کنترل کیفیت آزمایشگاه بیوشیمی بالینی، ارائه نتایج آزمایشگاهی پایدار، قابل اعتماد و دقیق است. برای دستیابی به این هدف، QC بر اصول زیر مبتنی است:

1. دقت: توانایی یک آزمایش در ارائه نتایجی نزدیک به مقدار واقعی.
2. تکرارپذیری: قابلیت بازتولید نتایج آزمایش در شرایط یکسان.
3. ویژگی: توانایی آزمایش برای اندازه‌گیری آنالیت موردنظر بدون تداخل از سایر مواد.
4. حساسیت: توانایی آزمایش در تشخیص مقادیر بسیار کم یک آنالیت.
5. قابلیت ردیابی: اطمینان از اینکه اندازه‌گیری‌ها با استانداردهای بین‌المللی قابل مقایسه هستند.

انواع کنترل کیفیت

کنترل کیفیت آزمایشگاه‌های بیوشیمی بالینی به دو دسته اصلی تقسیم می‌شود:

۱- کنترل کیفیت داخلی (IQC)

کنترل کیفیت داخلی درون آزمایشگاه انجام می‌شود تا عملکرد آزمایش‌ها به‌صورت روزانه پایش شود. این فرایند شامل:

• انجام نمونه‌های کنترل همراه با نمونه‌های بیماران.
• شناسایی خطاهای تصادفی و سیستماتیک.
• تضمین ثبات نتایج آزمایش‌ها در طول زمان.
• استفاده از ابزارهای آماری مانند نمودارهای لیوی-جنینگز و قوانین وستگارد.

۲- ارزیابی کیفیت خارجی (EQA) یا آزمون مهارت (PT)

EQA یک مقایسه بین آزمایشگاهی است که عملکرد آزمایشگاه را با استفاده از نمونه‌های خارجی استاندارد ارزیابی می‌کند. این برنامه:

• نتایج را در بین آزمایشگاه‌های مختلف مقایسه می‌کند.
• روندها و سوگیری‌های روش‌های آزمایش را شناسایی می‌کند.
• به حفظ اعتبارنامه و انطباق با مقررات کمک می‌کند.
• بازخوردی برای اقدامات اصلاحی فراهم می‌کند.

​

روش‌های کنترل کیفیت آزمایشگاه بیوشیمی بالینی

برای حفظ استانداردهای بالا در آزمایش‌های بیوشیمیایی، آزمایشگاه‌ها از روش‌های خاص QC پیروی می‌کنند، از جمله:

۱-انتخاب مواد کنترل کیفیت

مواد کنترل باید:

• ترکیبی مشابه نمونه‌های بیمار داشته باشند.
• در طول زمان پایدار باشند تا نتایج ثابتی ارائه دهند.
• در سطوح مختلف غلظتی (طبیعی، بالا و پایین) موجود باشند.
• مطابق با دستورالعمل‌های بین‌المللی  تولید شوند.

۲- تعیین دامنه کنترل

آزمایشگاه‌ها حدود قابل‌قبول کنترل را با تجزیه‌وتحلیل اندازه‌گیری‌های تکراری نمونه‌های QC و محاسبه موارد زیر تعیین می‌کنند:

• میانگین (مقدار متوسط اندازه‌گیری‌های تکراری).
• انحراف معیار (SD) برای ارزیابی تغییرات.
• ضریب تغییرات (CV%) برای اندازه‌گیری دقت.
• تعیین بازه اطمینان

۳- استفاده از ابزارهای آماری برای پایش QC

آزمایشگاه‌های بالینی برای تفسیر داده‌های QC به تکنیک‌های آماری مختلف متکی هستند:

• نمودارهای لیوی-جنینگ: نمایش گرافیکی نتایج QC در طول زمان که روندها و انحرافات را نشان می‌دهد.
• قوانین وستگارد: مجموعه‌ای از معیارهای آماری برای شناسایی خطاهای سیستماتیک و تصادفی مانند قوانین 1-2s، 2-2s، R-4s.
• نمودارهای (CUSUM) کنترل جمعی تجمعی: تشخیص تغییرات کوچک در عملکرد آزمایش در طول زمان.

۴- رفع اشکال در شکست‌های کنترل کیفیت

زمانی که نتایج QC خارج از محدوده‌های قابل‌قبول باشد، باید اقدامات اصلاحی انجام شود:

• تکرار آزمایش نمونه کنترل برای تأیید خطاها.
• بررسی کالیبراسیون دستگاه و یکپارچگی معرف‌ها.
• بررسی تکنیک کاربر برای شناسایی خطاهای احتمالی.
• ارزیابی شرایط محیطی مانند دما و رطوبت.
• ارزیابی دستورالعمل‌های تولیدکننده برای توصیه‌های رفع اشکال.

استانداردهای نظارتی و اعتباربخشی

​

آزمایشگاه‌های بالینی باید از مقررات بین‌المللی و ملی پیروی کنند تا کیفیت بالای آزمایش‌های بیوشیمیایی را تضمین کنند. برخی از سازمان‌های کلیدی در حوزه QC عبارت‌اند از:

• موسسه استانداردهای آزمایشگاهی بالینی (CLSI) ارائه دستورالعمل‌های QC شناخته‌شده جهانی.
• ISO 15189: استاندارد بین‌المللی برای مدیریت کیفیت آزمایشگاه‌های پزشکی.
• کالج آسیب‌شناسان آمریکا(CAP): ارائه آزمون مهارت خارجی و اعتباربخشی.
• اصلاحات آزمایشگاه‌های بالینی ( CLIA): تنظیم آزمایشگاه‌های ایالات متحده برای تضمین کیفیت و قابلیت اطمینان.

نقش اتوماسیون و سیستم‌های اطلاعاتی در کنترل کیفیت

پیشرفت‌های فناوری در اتوماسیون آزمایشگاهی و فناوری اطلاعات به‌طور قابل‌توجهی فرآیندهای QC را بهبود بخشیده‌اند:

• آنالیزورهای خودکار: کاهش خطاهای انسانی و افزایش قابلیت بازتولید آزمایش‌ها.
• نرم‌افزارهای میان‌افزار: یکپارچه‌سازی مدیریت داده‌های QC و شناسایی خودکار انحرافات.
• سیستم‌های مدیریت اطلاعات آزمایشگاهی (LIMS): متمرکزسازی داده‌های QC برای پایش آنی و انطباق نظارتی.

چالش‌های رایج در کنترل کیفیت آزمایشگاه بیوشیمی و راهکارها

با وجود تدابیر سختگیرانه QC، آزمایشگاه‌ها با چالش‌هایی روبرو هستند، مانند:

• تغییرات دسته‌ای معرف‌ها:
  • راهکار: انجام آزمایش‌های مقایسه‌ای هنگام تغییر دسته معرف‌ها.
• خطاهای انسانی در مدیریت نمونه‌ها:
  • راهکار: اجرای رویه‌های عملیاتی استاندارد (SOPs) و ارائه آموزش به کارکنان.
• انحراف دستگاه و مشکلات کالیبراسیون:
  • راهکار: انجام نگهداری پیشگیرانه منظم و بررسی کالیبراسیون.
• تداخلات همولیز، لیپمی یا ایکتر:
  • راهکار: استفاده از معیارهای رد نمونه مناسب و روش‌های جایگزین آزمایش.

نتیجه‌گیری

کنترل کیفیت آزمایشگاه‌ بیوشیمی بالینی برای اطمینان از نتایج دقیق، قابل‌اعتماد و تکرارپذیر ضروری است. اجرای اقدامات قوی QC داخلی و خارجی، استفاده از ابزارهای آماری پیشرفته و رعایت استانداردهای نظارتی، آزمایشگاه‌ها را در حفظ استانداردهای بالای مراقبت از بیمار یاری می‌کند. با پیشرفت فناوری، یکپارچه‌سازی تحلیل‌های مبتنی بر هوش مصنوعی، اتوماسیون و نرم‌افزارهای پیشرفته QC، کارایی و اثربخشی برنامه‌های کنترل کیفیت بیوشیمی را بهبود خواهد بخشید.

همچنین بخوانید:

• کارآموزی تکنسین علوم آزمایشگاهی

منبع

توالی‌یابی آکسفورد نانوپور: اصل، پروتکل، کاربردها

فهرست مطالب  نمایش 

توالی‌یابی آکسفورد نانوپور چیست؟

توالی‌یابی آکسفورد نانوپور یک روش توالی‌یابی نانوپور است که توسط Oxford Nanopore Technologies (ONT) توسعه یافته است که توالی نوکلئوتیدها را با عبور مولکول‌های منفرد از منافذ نانومقیاس و اندازه‌گیری تغییرات در جریان الکتریکی شناسایی می‌کند.

نانوپورها فقط عبور DNA تک رشته‌ای را به صورت ترتیب خطی اجازه می‌دهند. این روش، تحلیل در زمان (real-time) را ارائه می‌دهد و می‌تواند نوکلئوتیدها را از خوانش‌های کوتاه تا فوق‌العاده طولانی توالی‌یابی کند.

روش‌های تشخیص تک مولکولی (Single-molecule detection) مانند توالی‌یابی نانوپور(nanopore sequencing) در نسل سوم فناوری‌های توالی‌یابی گنجانده شده‌اند. مفهوم توالی‌یابی نانوپور در دهه 1980 توسعه یافت در حالی که اولین دستگاه توالی‌یابی نانوپور توسط ONT در دهه 2010 توسعه یافت. دستگاه‌های ONT توالی‌یابی نانوپور را به طور گسترده در دسترس قرار داده است. این روش در مطالعات ژنومی، شناسایی پاتوژن، تحلیل اپی‌ژنتیک و زمینه‌های مختلف دیگر استفاده می‌شود.

پیشینه تاریخی توالی‌یابی آکسفورد نانوپور

• در سال 1989، پروفسور دیوید دیامر برای اولین بار ایده استفاده از یک کانال پروتئینی در غشاها برای تشخیص نوکلئوتیدهای منفرد را مطرح کرد.
• در سال 1991، دیامر این ایده را با پروفسور دن برانتون از هاروارد مطرح کرد که منجر به اولین تلاش‌های تحقیقاتی مشترک در حس کردن نانوپور شد.
• آزمایش‌های اولیه با نانوپور سنسینگ (nanopore sensing) در سال 1993 با حضور پروفسور جورج چرچ در تیم همراه با چندین محقق دیگر آغاز شد. مفهوم توالی‌یابی نانوپور در سال 1996 منتشر شد.
• در سال 2001، پروفسور هاگان بیلی در دانشگاه آکسفورد یک حسگر نانوپور (nanopore sensor) کارآمد را توضیح داد. این امر منجر به تأسیس Oxford Nanopore Technologies در سال 2005 توسط پروفسور بیلی همراه با دکتر گوردون سانگهرا و دکتر اسپایک ویلکوکس شد.
• اولین داده‌های توالی‌یابی نانوپور در سال 2012 در یک کنفرانس ارائه شد که سیستم‌های MinION و GridION را معرفی کرد.
• MinION در سال 2014 از طریق برنامه دسترسی MinION(MAP) برای دسترسی کاربران اولیه راه‌اندازی شد و در سال 2015 به صورت تجاری عرضه شد.
• در سال 2016، دستگاه‌های جدید مانند SmidgION سازگار با موبایل و دستگاه آماده‌سازی نمونه خودکار VolTRAX اعلام شد.
• در سال 2017، این شرکت GridION X5 را راه‌اندازی کرد در حالی که PromethION در سال 2018 به صورت تجاری در دسترس بود.
• در سال 2019، آداپتور Flongle برای آزمایش‌های توالی‌یابی کوچک‌تر و کم‌هزینه راه‌اندازی شد.
• این شرکت در سال 2022 راه‌اندازی PromethION 2 را اعلام کرد.

اصل توالی‌یابی آکسفورد نانوپور

توالی‌یابی نانوپور بر اساس این مبنا کار می‌کند که زمانی که مولکول‌های اسید نوکلئیک از یک کانال نانوپور در یک غشاء که دو محفظه پر از الکترولیت را از هم جدا می‌کند عبور می‌کنند، جریان را مختل کرده و یک سیگنال الکتریکی مشخص تولید می‌کنند. محفظه‌ای که توالی‌یابی در آن اتفاق می‌افتد، سیس ساید (cis side) نامیده می‌شود، در حالی که محفظه حاوی آنالیت، ترانس ساید (trans side) نامیده می‌شود.

۱. باز شدن DNA و عبور از نانوپور:
• یک پروتئین موتوری، مولکول DNA را باز می‌کند و یک رشته از آن را به سمت نانوپور هدایت می‌کند.
• این رشته DNA از درون نانوپور عبور کرده و به سمت طرف مثبت غشا حرکت می‌کند.
۲. اندازه‌گیری جریان یونی و تشخیص نوکلئوتیدها:
• هر یک از چهار نوکلئوتید (آدنین، تیمین، سیتوزین و گوانین) به دلیل اندازه و شکل متفاوت، باعث ایجاد تغییرات مشخصی در جریان یونی عبوری از نانوپور می‌شود.
• این تغییرات در جریان یونی به صورت کاهش‌های مشخص ثبت شده و به عنوان سیگنال برای شناسایی هر نوکلئوتید استفاده می‌شود.

سرعت انتقال توسط پروتئین‌های موتوری که وجود دارند، کنترل میشود. این پروتئین‌ها همچنین فعالیت هلیکازی دارند که DNA دو رشته‌ای را به مولکول تک رشته‌ای باز می‌کنند.

هنگامی که ولتاژ به غشاء اعمال می‌شود، یک جریان یونی تولید می‌کند. همانطور که نوکلئوتیدها از نانوپور عبور می‌کنند، بار منفی آن‌ها باعث می‌شود که به سمت آند حرکت کنند، که جریان یونی را مختل کرده و یک الگوی مشخص تولید می‌کند. نوکلئوتیدهای مختلف جریان یونی را به طور متفاوتی تحت تأثیر قرار می‌دهند و به دلیل جرم و خواص الکتریکی خود الگوهای منحصر به فردی تولید می‌کنند. این الگو تشخیص داده شده و تفسیر می‌شود تا توالی نوکلئوتیدی تعیین شود.

فرایند توالی‌یابی آکسفورد نانوپور

استخراج DNA و آماده‌سازی کتابخانه

• مرحله اولیه شامل استخراج ماده ژنتیکی مورد نظر از نمونه‌های مختلف است.
• برای خوانش‌های بسیار طولانی، از روش‌های آزمایشی خاصی برای جداسازی DNA با وزن مولکولی بالا استفاده می‌شود. روش‌های مختلفی مانند استخراج ستون چرخشی (spin column)، مهره‌های مغناطیسی (magnetic bead) و فنول-کلروفرم (phenol-chloroform) برای استخراج DNA استفاده می‌شوند.
• ماده ژنتیکی استخراج شده ممکن است با استفاده از روش‌های برش فیزیکی (physical shearing) یا هضم آنزیمی به قطعات کوچک‌تر برای توالی‌یابی تقسیم شود.
• DNA قطعه شده می‌تواند تحت انتخاب اندازه اختیاری قرار گیرد تا قطعات با طول‌های خاص جداسازی شوند.
• DNA قطعه شده سپس ترمیم (اصلاح) (repaired) می‌شود تا اطمینان حاصل شود که انتهای قطعات DNA برای توالی‌یابی دقیق مناسب هستند.
• آداپتورها به انتهای قطعات DNA اضافه می‌شوند که به اتصال قطعات DNA به پروتئین‌های موتور و نانوپورها کمک می‌کنند.

فرآیند توالی‌یابی

• کتابخانه برای توالی‌یابی به یک سلول جریان معرفی می‌شود. این سلول حاوی دو محفظه پر از محلول یونی است که توسط غشایی حاوی نانوپورها از هم جدا شده‌اند.
• سلول جریان در داخل یک توالی‌یاب قرار می‌گیرد که در آن ولتاژ ثابتی اعمال می‌شود. این باعث ایجاد جریان یونی از طریق نانوپورها می‌شود.
• DNA مورد توالی‌یابی با پروتئین‌های موتوری مخلوط می‌شود که به DNA متصل می‌شوند. پروتئین موتور مارپیچ دو رشته‌ای را باز می‌کند و یک رشته را از طریق نانوپور منتقل می‌کند.
• هنگامی که DNA تک رشته‌ای از نانوپور عبور می‌کند، با جریان یونی تداخل می‌کند. هر نوکلئوتید باعث تغییر خاصی در جریان می‌شود که سیگنال‌های خاصی را تولید می‌کند. این سیگنال توسط یک تقویت‌کننده پچ-کلمپ (patch-clamp amplifier) تشخیص داده می‌شود.

تحلیل داده‌ها

• سیگنال‌ها با استفاده از الگوریتم‌های بازخوانی (base-calling algorithms) به توالی‌های DNA ترجمه می‌شوند که اندازه‌گیری‌های جریان خام را به توالی‌های نوکلئوتیدی تبدیل می‌کنند. این شامل تفسیر الگوهای خاص تغییرات جریان است. اصلاحات DNA یا RNA نیز با استفاده از بازخوانی (base calling) تشخیص داده می‌شوند.
• پس از بازخوانی (base calling) ، تصحیح خطا برای اصلاح داده‌های توالی انجام می‌شود. این خطاها را در توالی تصحیح می‌کند تا دقت داده‌های توالی‌یابی را بهبود بخشد.
• داده‌های توالی‌یابی با یک ژنوم مرجع هم‌تراز شده و مونتاژ (assemble) ژنوم انجام می‌شود.
• وارینت‌های ساختاری و مناطق تکراری پس از مونتاژ (assemble) و هم‌ترازی تشخیص داده می‌شوند.
• برای مطالعات ترانسکریپتوم، ایزوفرم‌های کامل ژن بازسازی می‌شوند و بیان ژن مطالعه می‌شود.

انواع توالی‌یابی آکسفورد نانوپور

سه روش توالی‌یابی نانوپور وجود دارد:

توالی‌یابی 2D

در توالی‌یابی 2D، هم الگو و هم رشته مکمل توالی‌یابی می‌شوند. توالی‌یابی 2D یکی از روش‌های اولیه استفاده شده توسط ONT بود. یک آداپتور سنجاق سر برای اتصال دو رشته استفاده می‌شود که ابتدا توالی‌یابی رشته الگو و سپس رشته مکمل را امکان‌پذیر می‌کند. این روش دقت بالاتری را ارائه می‌دهد زیرا هر دو رشته DNA را توالی‌یابی می‌کند. با این حال، از ماه مه 2017، ONT جریان 2D سلول‌ها (2D flow cells) را حذف کرده است.

توالی‌یابی 1D

در توالی‌یابی 1D، فقط رشته الگوی DNA توالی‌یابی می‌شود. DNA به طور مستقل با یک آداپتور لیگاسیون شده و برای توالی‌یابی از نانوپور عبور می‌کند. این روش ساده‌تر و سریع‌تر از توالی‌یابی 2D است اما دقت کمتری دارد و اطلاعات جزئی‌تری را در مقایسه با روش‌های دیگر ارائه می‌دهد.

توالی‌یابی 1D²

روش  1D²بر اصول توالی‌یابی 2D بنا شده است اما از سنجاق سرها برای اتصال رشته‌ها استفاده نمی‌کند. فقط یک رشته را در یک زمان توالی‌یابی می‌کند اما از آداپتورهای خاصی استفاده می‌کند که توالی‌یابی هر دو رشته را به طور مستقل در گذرهای جداگانه از طریق نانوپور امکان‌پذیر می‌کند. بنابراین، هر دو رشته الگو و مکمل را به طور مستقل توالی‌یابی می‌کند که دقت خوانش‌ها را افزایش می‌دهد.

انواع نانوپورها

نانوپورهای مورد استفاده در توالی‌یابی می‌توانند از منابع بیولوژیکی مشتق شده یا از مواد حالت جامد سنتز شوند.

1. نانوپورهای بیولوژیکی

نانوپورهای بیولوژیکی از پروتئین‌های طبیعی مشتق می‌شوند. آن‌ها معمولاً توسط میکروارگانیسم‌ها تولید می‌شوند. این‌ها شامل پروتئین‌های غشایی مانند α-همولیزین از استافیلوکوکوس اورئوس و پروتئین پورین A مایکوباکتریوم اسمگماتیس (MspA) هستند. این منافذ بیولوژیکی به طور طبیعی کانال‌هایی تشکیل می‌دهند که می‌توانند برای توالی‌یابی DNA استفاده شوند. این نانوپورها عمر کوتاه‌تری دارند و در مقایسه با نانوپورهای حالت جامد پایدارتر هستند.

2. نانوپورهای حالت جامد (Solid-state)

نانوپورهای حالت جامد یا مصنوعی (synthetic nanopores) از مواد حالت جامد مانند نیترات سیلیکون، اکسید آلومینیوم یا نانولوله‌های کربنی ساخته می‌شوند. نانوپورهای مصنوعی می‌توانند دقیقاً مطابق نیازهای مورد نیاز برای توالی‌یابی طراحی شوند. آن‌ها با استفاده از روش‌های مختلفی ایجاد می‌شوند که کنترل خواص نانوپورها را امکان‌پذیر می‌سازد.

دستگاه‌های توالی‌یابی آکسفورد نانوپور

1. MinION

MinION یک دستگاه توالی‌یابی آکسفورد نانوپور قابل حمل و جمع و جور است. این اولین دستگاه توالی‌یابی نانوپور است که در سال 2012 معرفی شد و در سال 2015 به صورت تجاری عرضه شد. MinION می‌تواند هر طول قطعات را، از کوتاه تا بسیار طولانی، توالی‌یابی کند. این دستگاه به راحتی از طریق یک کابل USB 3.0 استاندارد به هر کامپیوتری متصل می‌شود. این دستگاه برای کاربردهای مختلف از جمله ژنوم‌های کامل، متاژنومیکس، توالی‌یابی هدفمند و تحلیل ترانسکریپتوم مناسب است.

2. GridION

GridION یک دستگاه توالی‌یابی جمع و جور رومیزی است که می‌تواند 5 جریان سلولی MinION را همزمان اجرا کند. این دستگاه به همراه MinION در سال 2012 معرفی شد و در سال 2017 عرضه شد. این دستگاه امکان انجام همزمان چندین آزمایش توالی‌یابی را فراهم می‌کند. GridION همچنین از طول خوانش‌های کوتاه تا بسیار طولانی پشتیبانی می‌کند و تعداد زیادی نمونه را به طور کارآمد مدیریت می‌کند.

3. PromethION

PromethION یک دستگاه پر بازده مناسب برای پروژه‌های بزرگ است. این دستگاه دارای 24 یا 48 سلول جریان موازی است. این دستگاه در سال 2014 معرفی شد و در سال 2018 به صورت تجاری عرضه شد. این سیستم از طیف گسترده‌ای از کاربردهای توالی‌یابی از پروژه‌های کوچک تا مطالعات مقیاس جمعیت پشتیبانی می‌کند.

4. Flongle

Flongle یک آداپتور برای MinION یا GridION است که در سال 2019 عرضه شد. این دستگاه برای آزمایش‌های توالی‌یابی کوچکتر مناسب است. Flongle به کاربران اجازه می‌دهد در صورت نیاز نمونه‌های منفرد را بدون نیاز به چندگانه‌سازی اجرا کنند. این دستگاه در توالی‌یابی آمپلیکون، کنترل کیفیت و سایر آزمایش‌های کوچک توالی‌یابی کاربرد دارد.

از بالا: نمونه در اینجا به سلول جریان اضافه می‌شود خروجی معمول داده‌ی: 1-2 گیگابایت آداپتور قابل استفاده مجدد که امکان اتصال جریان سلول کوچکتر را فراهم می‌کند سازگار با دستگاه‌های MinION و GridION

مزایای توالی‌یابی آکسفورد نانوپور

• توالی‌یابی آکسفورد نانوپور داده‌های در زمان (real-time) ارائه می‌دهد و می‌تواند به هر اندازه دستگاهی مقیاس شود که برای نیازهای آزمایشی مختلف مناسب باشد.
• دستگاه‌های توالی‌یابی آکسفورد نانوپور مانند MinION جمع و جور و قابل حمل هستند که توالی‌یابی حتی خارج از محیط‌های آزمایشگاهی سنتی را امکان‌پذیر می‌سازد.
• این دستگاه‌ها همچنین شامل دستگاه‌هایی هستند که آماده‌سازی سریع کتابخانه را امکان‌پذیر می‌کنند که فرآیند توالی‌یابی را سرعت می‌بخشد.
• پارامترهای مختلف در توالی‌یابی آکسفورد نانوپور مانند مدت زمان آزمایش، دستگاه استفاده شده و تعداد جریان سلول‌ها استفاده شده می‌توانند با نیازهای تحقیقاتی خاص تنظیم شوند.
• دستگاه‌های توالی‌یابی آکسفورد نانوپور می‌توانند قطعات طولانی DNA را توالی‌یابی کنند که از طول خوانش‌های بسیار طولانی پشتیبانی می‌کنند.
• خوانش‌های طولانی مونتاژ (assemble) ژنوم را ساده می‌کنند. توالی‌یابی آکسفورد نانوپور می‌تواند مستقیماً DNA یا RNA بومی را بدون تکثیر PCR توالی‌یابی کند که خطا را کاهش می‌دهد.

محدودیت‌های توالی‌یابی آکسفورد نانوپور

• توالی‌یابی نانوپور در مقایسه با سایر فناوری‌های توالی‌یابی دارای نرخ خطای بالاتری است زیرا تفسیر دقیق اختلالات جریان یونی ایجاد شده توسط نوکلئوتیدهایی که از نانوپور عبور می‌کنند دشوار است.
• یکی دیگر از محدودیت‌های توالی‌یابی آکسفورد نانوپور نیاز به مقادیر زیادی از ماده اسید نوکلئیک ورودی است.
• داده‌های توالی‌یابی نانوپور می‌توانند پیچیده باشند. ابزارهای پیشرفته بیوانفورماتیک و منابع محاسباتی برای تفسیر دقیق داده‌ها مورد نیاز هستند.
• این دستگاه دارای بازده پایین‌تری است که کاربردهای آن را در مطالعات مقیاس بزرگ محدود می‌کند.
• توالی‌یابی نانوپور می‌تواند نسبت به آماده‌سازی نمونه و آلودگی حساس باشد. تولید مداوم خوانش‌های بسیار طولانی می‌تواند دشوار باشد و عواملی مانند کیفیت DNA ممکن است بر طول خوانش‌ها تأثیر بگذارند.

کاربردهای توالی‌یابی آکسفورد نانوپور

• قابلیت خوانش طولانی توالی‌یابی آکسفورد نانوپور در شناسایی و مطالعه واریانت‌های ژنتیکی و ایزوفرم‌های جدید کمک می‌کند. این امر در درک شرایط و بیماری‌های ژنتیکی پیچیده مفید است.
• توالی‌یابی نانوپور برای مطالعه تغییرات ساختاری در ژنوم‌های سرطان استفاده می‌شود که برای تشخیص و نظارت بر سرطان مهم است.
• توالی‌یابی نانوپور می‌تواند در شناسایی میکروارگانیسم‌ها استفاده شود. این امر در طبقه‌بندی و نظارت بر میکروب‌ها کمک می‌کند. همچنین در تشخیص پاتوژن و پروفایل مقاومت آنتی‌بیوتیکی برای شناسایی ژن‌های مقاومت از نمونه‌های بالینی و نظارت بر شیوع بیماری‌های عفونی استفاده می‌شود.
• توالی‌یابی نانوپور می‌تواند برای مونتاژ (assemble) مناطق بسیار تکراری و تغییرات ساختاری منجر به مونتاژ کامل‌تر ژنوم استفاده شود. توالی‌یابی نانوپور می‌تواند اصلاحات DNA مانند الگوهای متیلاسیون را تشخیص دهد که برای درک اصلاحات اپی‌ژنتیکی مفید است. دستگاه‌های ONT مانند MinION قابل حمل هستند که تحقیقات میدانی مانند شناسایی میکروب‌ها در رودخانه‌های آلوده و آفات در مزارع کشاورزی را امکان‌پذیر می‌سازند.

همچنین بخوانید:

• NGS چیست؟
• توالی یابی ایلومینا چیست؟
• توالی یابی DNA به روش سنگر + ویدیو آموزشی

مترجم: محمد صادق محمودی لرد

تکنیک رنگ آمیزی آلبرت: اصول، روش انجام و نتایج

مقدمه‌ای بر رنگ آمیزی آلبرت

رنگ آمیزی‌های مختلفی در طول زمان ابداع شده‌اند تا گونه‌های باکتری را متمایز کنند و آنها را از نظر مورفولوژیکی و ویژگی‌های خاصی که دارند، از هم جدا کنند. محبوب‌ترین رنگ آمیزی‌ها، رنگ آمیزی گرم، رنگ آمیزی اسید فست و رنگ آمیزی اندوسپور است. هدف هر رنگ آمیزی شناسایی و تعریف باکتری‌ها بر اساس شکل و مورفولوژی آنها است.

در این نوع رنگ آمیزی، برای شناسایی باکتری‌ها از ساختارهای خاصی به نام گرانول‌های متاکروماتیک استفاده می‌شود. سایر تکنیک‌های رنگ آمیزی که برای تعیین وجود گرانول‌هایی در داخل غشای سیتوپلاسمی باکتری‌ها به کار می‌روند شامل رنگ آمیزی Pugh و همچنین Nessers است. رنگ آمیزی آلبرت به وضوح گرانول‌های متاکروماتیک موجود در کورینه باکتریوم دیفتری را شناسایی می‌کند.

کورینه باکتری‌ها باکتری‌های گرم مثبت، بدون اسپور و غیر متحرکی هستند که دارای گرانول‌های متاکروماتیک (Volutin) هستند که اجسام درون‌سلولی را تشکیل می‌دهند که در لایه سیتوپلاسمی برخی از سلول‌های باکتری یافت می‌شوند تا امکان ذخیره‌سازی پلی فسفات معدنی (پلی-P) را فراهم کنند و همچنین آنزیم‌ها هنگامی که این گرانول‌ها با استفاده از رنگ متیلن آبی  رنگ آمیزی می‌شوند، رنگ قرمز مایل به بنفش نشان می‌دهند.

شناخته‌شده‌ترین کورینه باکتریوم را می‌توان کورینه باکتریوم دیفتری نامید. این گونه، عامل بیماری دیفتری است که یک بیماری نازوفارنکس است که به دنبال فرآیند کلونیزاسیون باکتریایی و عفونت روی پوست نیز تأثیر می‌گذارد.

روش کار به این صورت است که باکتری‌ها ابتدا در محیط‌های خاصی مانند لوفلر آگار یا آگار مولر-میلر و آگار تین‌دیل تلوریت کشت می‌شوند. سپس کلنی جدا می‌شود تا کشت‌های مایعی ایجاد شود که بعداً برای رنگ آمیزی استفاده می‌شوند. رنگ آمیزی آلبرت فقط به عنوان یک  رنگ آمیزی مثبت برای باکتری عمل می‌کند. به عنوان یک  رنگ آمیزی افتراقی فقط گرانول‌های ولوتین را رنگ می‌کند، بنابراین باکتری‌هایی که این دانه‌ها را ندارند با این روش شناسایی یا رنگ آمیزی نمی‌شوند.

هدف رنگ آمیزی آلبرت

• شناسایی و رنگ آمیزی گرانول‌های متاکروماتیک کورینه باکتریوم دیفتری.

اصول رنگ آمیزی آلبرت

رنگ آمیزی آلبرت روشی برای یافتن اجسام گرانوله متاکروماتیک در کورینه باکتریوم دیفتری است. رنگ آلبرت از دو محلول رنگ آمیزی تشکیل شده است. مانند محلول آلبرت 1 و محلول آلبرت 2. محلول آلبرت 1 از مالاشیت گرین، تولوییدین بلو، اسیدهای استیک و الکل تشکیل شده است. محلول آلبرت 2 از ید و همچنین پتاسیم یدید موجود در آب تشکیل شده است.

برای استفاده از این محلول رنگ آمیزی، هر دو محلول باید با درصد مناسبی از مواد درست شوند تا گرانول‌ها پس از  رنگ آمیزی، رنگ مناسبی پیدا کنند.

محلول رنگ آمیزی آلبرت 1 به عنوان عامل  رنگ آمیزی عمل می‌کند، در حالی که محلول آلبرت 2 به عنوان یک عنصر یونی عمل می‌کند که رنگهای شیمیایی را به هم متصل می‌کند و آن را نگه می‌دارد تا به میکروارگانیسم بچسبد.

تولوییدین بلو “O” و مالاشیت گرین هر دو رنگهای اساسی با میل ترکیبی بالا برای بافت‌های دارای اجزای اسیدی مانند سیتوپلاسم هستند. PH  رنگ آمیزی آلبرت را می‌توان با استفاده از اسید استیک روی 2.8 تنظیم کرد که سپس به محیط مناسبی برای گرانول‌های ولوتین تبدیل می‌شود زیرا pH گرانول‌های ولوتین بسیار اسیدی است.

هنگام استفاده از این رنگ آمیزی روی اسمیر، تولوئیدین بلو O، ذرات ولوتین را رنگ می‌کند و مالاشیت گرین سیتوپلاسم سلول را به رنگ آبی مایل به سبز رنگ می‌کند. در صورت افزودن ید، اثر متاکروماتیک مشهود نیست و گرانول‌ها آبی رنگ به نظر میرسند.

ترکیبات رنگ آمیزی آلبرت

محلول آلبرت 1

عناصر	مقادیر
تولوئیدین بلو	0.15 gm
مالاشیت گرین	0.20 gm
اسید استیک گلاسیال	1 ml
الکل (اتانول 95%)	2 ml

محلول آلبرت 2

عناصر	مقادیر
ید	2 gm
پتاسیم یدید (KI)	3 gm

 آماده سازی محلول

تهیه محلول رنگ آمیزی آلبرت1، در حجم 100 میلی‌لیتر

1. 0.1 میلی‌لیتر اسید استیک گلاسیال را در 100 میلی‌لیتر آب اضافه کنید.
2. 2 میلی‌لیتر اتانول 95 درصد را در محلول بریزید.
3. سپس 0.15 گرم تولوییدین بلو را در محلول حل کنید.
4. سپس 0.2 گرم مالاشیت گرین را در محلول حل کنید.

تهیه 300 میلی‌لیتر محلول رنگ آمیزی آلبرت 2

1. 2 گرم ید را در 50 میلی‌لیتر آب مقطر حل کنید.
2. 250 میلی‌لیتر آب به محلول اضافه کنید.
3. 3 گرم پتاسیم یدید را در محلول حل کنید.

فرآیند رنگ آمیزی

به دو مرحله تقسیم می‌شود:

الف. رنگ آمیزی:

1. به صورت آسپتیک یکی از حلقه‌های کورنی باکتریوم دیفتری را بردارید.
2. یک لکه از رنگ را در مرکز لام شیشه‌ای شفاف قرار دهید.
3. حرارت را اعمال کنید تا رنگ آمیزی به آرامی تثبیت شود.
4. شیشه اسمیر را روی رک رنگی قرار دهید.
5. محلول رنگ آمیزی آلبرت 1 را به اسمیر اضافه کنید و بگذارید 3-5 دقیقه بماند.
6. اسلاید باید با فشار ملایمی از آب تمیز شود.

ب. تثبیت

1. محلول رنگ آمیزی 2 را اضافه کنید و اجازه دهید 1 دقیقه بماند.
2. اسلاید را می‌توان با آب ملایم تمیز کرد.
3. لکه را خشک کنید تا لام خشک شود.
4. روغن چوب سدر را روی اسمیر بمالید.
5. سپس، زیر میکروسکوپ به کمک روغن، نمونه را در 1000x مشاهده کنید.

تفسیر نتایج

گرانول‌های متاکروماتیک به صورت سیاه مایل به آبی رنگ می‌شوند، در حالی که سلول‌های باقی مانده میکروبیوم به رنگ سبز رنگ می‌شوند.

غشای سیتوپلاسمی کورینه باکتریوم دیفتری حاوی گرانول‌های ولوتین معروف به متاکروماتیک است که از ویژگی‌های متمایز این باکتری است. فرآیند  رنگ آمیزی که بر پایه محلول‌های آلبرت است، گرانول‌ها را رنگ‌‌دار می‌کند و در نتیجه آن‌ها به صورت نقاط سیاهی به شکل گرد در پایین یک باسیل سبز L یا V شکل ظاهر می‌شوند.

کاربردها

• معمولاً برای شناسایی گرانول‌های متاکروماتیک موجود در میکروارگانیسم‌های عامل ایجاد بیماری مانند کورینه باکتریوم دیفتری استفاده می‌شود.
• به عنوان نوعی رنگ آمیزی افتراقی، به تشخیص کورینه باکتریوم دیفتری از دیفتروئیدهای غیربیماری‌زا بدون گرانول متاکروماتیک کمک می‌کند.

محدودیت‌ها

• برای رنگ آمیزی گرانول متاکروماتیک و تشخیص عدم وجود اجسام انکلوزیونی در غشای سیتوپلاسمی استفاده می‌شود.

سوالات متداول

رنگ آمیزی آلبرت چیست؟

رنگ آمیزی آلبرت نوعی تکنیک رنگ آمیزی است که در میکروبیولوژی برای شناسایی و تمایز بین باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت استفاده می‌شود.

مراحل رنگ آمیزی آلبرت چیست؟

مراحل رنگ آمیزی آلبرت شامل تثبیت حرارتی، رنگ آمیزی اولیه، رنگ زدایی و مشاهده زیر میکروسکوپ است.

رنگ آمیزی آلبرت چگونه انجام می‌شود؟

رنگ آمیزی آلبرت با استفاده از دو رنگ و نوعی رنگ آمیزی اولیه کار می‌کند.  رنگ آمیزی اولیه برای رنگ آمیزی سلول‌های باکتریایی استفاده می‌شود.

هدف از رنگ آمیزی آلبرت چیست؟

هدف از رنگ آمیزی آلبرت شناسایی و تمایز بین باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت بر اساس ویژگی‌های رنگ آمیزی آنها است.

رنگ‌های مورد استفاده در رنگ آمیزی آلبرت چیست؟

رنگ‌های مورد استفاده در رنگ آمیزی آلبرت معمولاً کریستال ویوله برای رنگ آمیزی اولیه و سافرانین است.

رنگ آلبرت در مقایسه با سایر تکنیک‌های رنگ آمیزی چگونه است؟

رنگ آمیزی آلبرت مشابه سایر تکنیک‌های رنگ آمیزی افتراقی مانند  رنگ آمیزی گرم است، اما تفاوت‌های کلیدی دارد. در مقایسه با  رنگ آمیزی گرم، راحت‌تر است و به زمان کمتری نیاز دارد، اما اختصاصی نیست و ممکن است اطلاعات زیادی در مورد باکتری مورد مطالعه ارائه ندهد.

مزایای رنگ آمیزی آلبرت چیست؟

از مزایای رنگ آمیزی آلبرت می‌توان به سادگی، هزینه کم و توانایی تمایز بین باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت اشاره کرد.

آیا می‌توان از رنگ آلبرت در کنترل کیفیت آب و غذا استفاده کرد؟

بله، رنگ آلبرت را می‌توان در کنترل کیفیت آب و غذا برای شناسایی وجود باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت که می‌تواند نشان دهنده آلودگی باشد استفاده کرد.

کاربردهای رنگ آمیزی آلبرت در تحقیقات باکتریایی چیست؟

کاربردهای رنگ آمیزی آلبرت در تحقیقات باکتریایی شامل مطالعه مورفولوژی، طبقه بندی و شناسایی باکتری‌ها و همچنین بررسی رشد باکتری و فرآیندهای متابولیک است.

هنگام انجام رنگ آمیزی آلبرت چه اقداماتی باید رعایت شود؟

اقدامات احتیاطی که باید هنگام انجام رنگ آمیزی آلبرت انجام شود شامل پوشیدن دستکش و لباس مناسب، استفاده از هود برای جلوگیری از قرار گرفتن در معرض مواد شیمیایی سمی و دور ریختن مواد استفاده شده برای جلوگیری از آلودگی است.

همچنین بخوانید:

• انواع رنگ‌آمیزی مورد استفاده در میکروبیولوژی
• کورینه باکتریوم دیفتری (C. Diphtheriae): زیستگاه، مورفولوژی، ویژگی‌ها و بیماری‌زایی
• محیط کشت لوفلر (Loeffler Medium): ترکیب، اصول، روش آماده‌سازی، نتایج و موارد استفاده
• رنگ آمیزی تریکروم ویتلی (Wheatley Trichrome Staining): تعریف، اصول، روش و تفسیر نتایج

مترجم: معصومه قریبی ششده

انواع رنگ‌آمیزی مورد استفاده در میکروبیولوژی

مقدمه‌ای بر انواع رنگ‌آمیزی مورد استفاده در میکروبیولوژی

انواع مختلفی از رنگ‌آمیزی وجود دارد که در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی برای رنگ‌آمیزی سلول‌های باکتریایی استفاده می‌شود. همه این رنگ‌آمیزی‌ها در ادامه لیست شده‌اند.

انواع رنگ‌آمیزی

رنگ‌آمیزی‌های مختلف روی نواحی مختلف بافت یا سلول واکنش نشان می‌دهند یا متمرکز می‌شوند. تعدادی از شناخته‌شده‌ترین روش‌های رنگ‌آمیزی بیولوژیکی را می‌توان در ادامه مشاهده کرد.

1. آکریدین اورنج

آکریدین اورنج (AO) یک رنگ کاتیونی فلورسنت مخصوص اسید نوکلئیک است که برای تعیین چرخه سلولی مفید است. نوعی رنگ قابل نفوذ در سلول است و با DNA و از طریق جاذبه الکترواستاتیکی یا درونی تعامل دارد. هنگامی که به DNA متصل می‌شود از نظر طیفی بسیار شبیه فلوئورسئین است. مانند فلوئورسئین، این یک رنگ غیر اختصاصی فوق‌العاده است که می‌تواند برای نور پس زمینه سلول‌های معمولی رنگ‌آمیزی که روی سطح بافت قرار دارند، استفاده شود (رنگ‌آمیزی با نور پس زمینه فلورسانس).

2. بیسمارک براون (قهوه‌ای)

بیسمارک براون (همچنین قهوه‌ای بیسمارک Y یا قهوه‌ای منچستر) رنگ زردی برای موسین‌های اسیدی و رنگ قهوه‌ای تیره روی ماست سل‌ها ایجاد می‌کند. نقطه ضعف این رنگ‌آمیزی این است که هر ساختار دیگری را که در اطراف آن قرار دارد را مسدود و در نتیجه کیفیت کنتراست را ضعیف می‌کند. برای اثربخشی باید آن را با سایر رنگ‌آمیزی‌ها جفت کرد. چند رنگ‌آمیزی مکمل که می‌توان با بیسمارک براون استفاده کرد عبارتند از هماتوکسیلین و تولوئیدین بلو که کنتراست بهتری را در نمونه بافت شناسی ارائه می‌دهند.

3. کارمین (Carmine)

کارمین رنگ قرمز است که برای رنگ‌آمیزی گلیکوژن استفاده می‌شود. آلومینیوم کارمین یک نوع رنگ‌آمیزی هسته‌ای است. رنگ‌آمیزی کارمین در نتیجه استفاده از رنگدانه (معمولاً آلومینیومی) است.

4. کوماسی بلو

کوماسی بلو (آبی درخشان) به طور خاص اثری بر پروتئین‌ها ندارد و آنها را رنگ نمی‌کند و رنگ آبی روشنی دارد. اغلب در الکتروفورز در ژل استفاده می‌شود.

5. کرسیل ویوله یا ارغوانی

کرسیل ویوله رنگی است که اسیدهایی را در سیتوپلاسم سلول‌های عصبی با رنگ بنفش، به ویژه جسم نیسل می‌دهد. اغلب در تحقیقات بر روی مغز استفاده می‌شود.

6. کریستال ویوله

رنگی است که برای رنگ‌آمیزی گرم استفاده می‌شود. هنگامی که با یک ماده خشک کننده مناسب همراه می‌شود، دیواره‌های سلولی را با رنگ بنفش رنگ‌آمیزی می‌کند.

7. دپی (Dapi)

دپی نوعی رنگ‌آمیزی فلورسنت هسته‌ای است که توسط نور ماوراء بنفش تحریک می‌شود و هنگامی که به DNA متصل می‌شود فلورسانس آبی قابل توجهی را نشان می‌دهد. به تکرارهای غنی از A=T روی کروموزوم‌ها متصل می‌شود. می‌توان از آن در سلول‌های ثابت یا زنده استفاده کرد. سلول‌های رنگ‌آمیزی شده با روش دپی به ویژه برای شمارش سلول‌ها مناسب هستند.

8. ائوزین

ائوزین بیشتر برای تضاد با هماتوکسیلین استفاده می‌شود. رنگ قرمز یا صورتی را به غشاهای سلولی و همچنین برخی از ساختارهای خارج سلولی می‌بخشد. همچنین رنگ قرمز را بر روی گلبول‌های قرمز خون ایجاد می‌کند. ائوزین همچنین به عنوان ضد رنگ‌ برای انواع خاصی از رنگ‌آمیزی گرم و در روش‌های مختلف دیگر استفاده می‌شود.

در واقع دو ترکیب مشابه وجود دارد که معمولاً به نام ائوزین شناخته می‌شود. متداول‌ترین، ترکیب ائوزین Y (همچنین ائوزین Y WS یا ائوزین زرد رنگ نیز نامیده می‌شود) است و رنگ آن کمی زرد است. یکی دیگر از ترکیبات ائوزین، ائوزین B است که رنگ آبی کم رنگی دارد. هر دو رنگ را می‌توان به جای هم استفاده کرد و انتخاب بر اساس ترجیح و سفارش است.

9. اتیدیوم بروماید

اتیدیوم بروماید DNA را رنگ‌آمیزی می‌کند و رنگی به رنگ قرمز متمایل به نارنجی تولید می‌کند. اگرچه نمی‌تواند سلول‌های سالم را رنگ‌آمیزی کند، اما می‌تواند برای تشخیص سلول‌ها در آخرین مراحل آپوپتوز استفاده شود. این سلول‌ها غشای سلولی بسیار نفوذپذیری دارند. به همین دلیل است که اتیدیوم بروماید معمولاً به عنوان یک نشانگر برای تشخیص آپوپتوز سلول‌ها و همچنین برای شناسایی نوارهای DNA در ژل الکتروفورز استفاده می‌شود.

این رنگ‌آمیزی همچنین می‌تواند همراه با آکریدین (AO) برای شمارش سلول‌های زنده مورد استفاده قرار گیرد. این رنگ‌آمیزی ترکیبی باعث می‌شود سلول‌های زنده سبز نشان داده شوند، در حالی که سلول‌های در حال مرگ فلورسانس متمایز قرمز-نارنجی را حفظ می‌کنند.

10. اسید فوشین

اسید فوشین را می‌توان برای رنگ‌آمیزی کلاژن، ماهیچه صاف یا میتوکندری استفاده کرد. فوشین اسیدی را می‌توان به عنوان رنگ سیتوپلاسمی و هسته‌ای در روش تری کروم مالوری استفاده کرد. در مورد اسید پیکروفوکسین Van Gieson، فوشین رنگ قرمز خود را به فیبرهای کلاژن می‌دهد. اسید فوشین همچنین می‌تواند یک رنگ شناخته شده برای میتوکندری باشد (روش آلتمن).

11. هماتوکسیلین

هماتوکسیلین (هماتوکسیلین در آمریکای شمالی) یک نوع رنگ‌آمیزی هسته‌ای است. رنگ‌آمیزی هسته‌ها به رنگ آبی مایل به بنفش یا قهوه ای، همراه با ماده خشک کننده استفاده می‌شود. معمولاً همراه با ائوزین برای روش رنگ‌آمیزی H&E (هماتوکسیلین و ائوزین)، که یکی از رایج‌ترین تکنیک‌های مورد استفاده در بافت‌شناسی است، استفاده می‌شود.

12. رنگ‌آمیزی‌ هوچست

هوچست یک ماده شیمیایی مشتق از بیس بنزیمیدازول است که قادر است به شیارهای کوچک DNA متصل شود. اغلب در میکروسکوپ‌های فلورسانس برای کمک به رنگ‌آمیزی DNA استفاده می‌شود. رنگ‌آمیزی هوچست زمانی که در محلول‌های آبی حل می‌شود زرد است. آنها همچنین نور آبی را هنگام قرار گرفتن در معرض محرک فرابنفش از خود ساطع می‌کنند.

دو نوع اصلی هوچست وجود دارد:

• هوچست 33258
• هوچست 33342

هر دو از نظر عملکردی یکسان هستند، اما با تفاوت‌های جزئی در ساختار. هوچست 33258 دارای یک گروه هیدروکسیل در قسمت انتهایی است و در نتیجه محلولیت بیشتری در آب دارد اما این امر قابلیت نفوذ به غشای پلاسما را نیز کاهش می‌دهد. هوچست 3342 دارای یک جایگزین مبتنی بر اتیل برای گروه پایانی هیدروکسیل (یعنی گروه‌های اتیل اتر) است که آن را آبگریزتر می‌کند و جریان غشای پلاسما را تسهیل می‌کند.

13. ید

ید در شیمی برای نشان دادن نشاسته استفاده می‌شود. هنگامی که نشاسته با ید در یک محلول ترکیب می‌شود، رنگ آبی تیره ایجاد می‌کند که نشانه‌ای از ترکیب نشاسته / ید است. نشاسته جزئی است که در تمام سلول‌های گیاهی مشترک است و بنابراین محلول ضعیف ید می‌تواند نشاسته سلول‌ها را رنگ‌آمیزی کند. ید جزء فرآیند رنگ‌آمیزی به نام رنگ‌آمیزی گرم است که در میکروبیولوژی به کار می‌رود. به عنوان ماده‌ای که در رنگ‌آمیزی گرم استفاده می‌شود، جریان رنگ را از طریق منافذ در غشای سلول یا دیواره سلولی افزایش می‌دهد.

محلول لوگول که به نام ید لوگول (IKI) نیز شناخته می‌شود، محلول قهوه‌ای رنگی است که در مواجهه با نشاسته به رنگ سیاه تغییر می‌کند. همچنین برای رنگ‌آمیزی سلول‌ها استفاده می‌شود که باعث آشکارتر شدن هسته‌های سلول می‌شود.

با استفاده از محلول لوگول از سرکه معمولی (اسید استیک) می‌توان برای تعیین تغییرات پیش سرطانی یا سرطانی در بافت‌های واژن و دهانه رحم در آزمایش‌های «پاپ اسمیر» که برای آماده شدن برای بیوپسی پیگیری می‌شود، استفاده کرد. اسید استیک باعث سفید شدن سلول‌های غیرطبیعی می‌شود، در حالی که بافت‌های طبیعی به دلیل وجود ید، قهوه‌ای رنگ می‌شوند.

14. مالاکیت سبز

مالاکیت سبز (همچنین به نام الماس سبز B یا ویکتوریا سبز B نیز نامیده می‌شود) برای رنگ‌آمیزی رنگ سبز آبی برای سافرانین در روش رنگ‌آمیزی گیمنز برای باکتری‌ها و همچنین برای رنگ‌آمیزی مستقیم ‌هاگ‌ها استفاده می‌شود.

15. متیل گرین

متیل گرین معمولاً هنگام استفاده از میدان‌های روشن و همچنین با میکروسکوپ‌های فلورسانس برای رنگ‌آمیزی کروماتین سلول‌ها استفاده می‌شود تا بتوان آنها را راحتتر مشاهده کرد.

16. متیلن بلو

متیلن بلو را می‌توان برای رنگ‌آمیزی سلول‌های حیوانات، مانند سلول‌های انسان، برای افزایش دید هسته آنها استفاده کرد. همچنین برای رنگ‌آمیزی اسمیر خون محیطی در زمینه سیتولوژی استفاده می‌شود.

17. نوترال رد

نوترال رد (یا رنگ toluylene) رنگ قرمز خنثی است (همچنین به عنوان toluylene قرمز نیز شناخته می‌شود). اغلب به عنوان یک ترکیب ضدرنگ همراه با رنگ‌های مختلف استفاده می‌شود.

18. نیل بلو

نیل بلو (یا نیل آبی A) هسته‌ها را به رنگ آبی در می‌آورد. می‌توان آن را همراه با سلول‌های زنده استفاده کرد.

19. نیل رد (قرمز)

نیل قرمز (همچنین اکسازون آبی نیل نامیده می‌شود) از طریق جوشاندن نیل بلو در اسید سولفوریک ایجاد می‌شود. نتیجه آن مخلوطی با نیل قرمز و همچنین نیل بلو است. نیل قرمز را می‌توان به عنوان یک لکه چربی دوست توصیف کرد، می‌تواند به گلبول‌های چربی در سلول‌ها جذب شود و سلول‌ها را با رنگ قرمز رنگ‌آمیزی کند. قرمز نیل رنگی است که می‌تواند در سلول‌های زنده استفاده شود. هنگامی که به لیپیدها تقسیم می‌شود فلورسانس قوی دارد، اما هرگز در محلول‌های آبی نیست.

20. تتروکساید اوسمیوم (نام رسمی: تترا اکساید اوسمیوم)

از تترااکسید اسمیم در میکروسکوپ نوری برای رنگ‌آمیزی لیپیدها استفاده می‌شود. در چربی‌ها حل می‌شود و سپس توسط مواد آلی به اسمیم عنصری تبدیل می‌شود. نوعی ماده سیاه و قابل مشاهده است.

21. پروپیدیوم یدید

پروپیدیوم یدید یک عامل بینابینی ساطع کننده نور است که برای رنگ‌آمیزی سلول‌ها استفاده می‌شود. پروپیدیوم یدید برای رنگ‌آمیزی DNA در فلوسایتومتری برای ارزیابی زنده ماندن سلول‌ها یا محتوای DNA در طول تجزیه و تحلیل چرخه سلولی و همچنین استفاده از میکروسکوپ به منظور مشاهده هسته و همچنین سایر اندامک‌های حاوی DNA استفاده می‌شود. پروپیدیوم یدید نمی‌تواند از غشای سلولی عبور کند و بنابراین قادر به جداسازی سلول‌های نکروز، آپوپتوز و سالم است. همچنین، PI یک پروتئین متصل به RNA است که برای تمایز بین رنگ‌آمیزی DNA و RNA نیاز به تیمار با نوکلئازها دارد.

22. رودامین

رودامین یک رنگ پروتئینی خاص است که برای میکروسکوپ فلورسانس استفاده می‌شود.

23. سافرانین

سافرانین (یا سافرانین O) رنگ قرمز یونی است و نوعی عامل اتصال دهنده برای هسته‌ها (DNA) و بافت‌های مختلف دیگر مانند گلیکوزامینوگلیکان‌ها است که در غضروف، ماست سل‌ها و همچنین اجزای پلاستیدها و لیگنین در بافت گیاهان یافت می‌شود.

سافرانین یک رنگ طبیعی گران قیمت است که در روش‌های خاصی برای دادن رنگ زرد به کلاژن استفاده می‌شود، برخلاف رنگ‌های قرمز و آبی که سایر رنگ‌ها به سیتوپلاسم و هسته‌های سیتوپلاسم بافت‌های جانوری (از جمله انسان) می‌دهند.

همچنین بخوانید:

• آموزش رنگ آمیزی گرم
• رنگ‌ آمیزی سلول‌ ها با رنگ‌ های هوچست Hoechst و DAPI
• رنگ آمیزی تریکروم ویتلی (Wheatley Trichrome Staining): تعریف، اصول، روش و تفسیر نتایج
• رنگ آمیزی اندوسپور (Endospore Staining): اصول، شناساگرها، روش و نتیجه
• رنگ آمیزی سلول: رنگ‌آمیزی اختصاصی سلولی برای تشخیص تمایز
• رنگ آمیزی کالکوفلور سفید: اصول، روش، نتایج و کاربردها

مترجم: معصومه قریبی ششده

منبع

پیپت چند کاناله (Multichannel Pipette): اجزا و کالیبراسیون

فهرست مطالب  نمایش 

مقدمه‌ای بر پیپت چند کاناله

نمونه برداری با پیپت برای جابجایی مایعات بدون آلوده شدن، ایده‌آل است. برخی از روش‌ها نیاز به انتقال یک مایع در چندین چاهک یا لوله را دارند. بنابراین تغییر روش انتقال به جابجایی با یک پیپت چند کاناله ایده خوبی است.

پیپت‌های چند کاناله، پیپت‌هایی هستند که کانال‌ها یا شفت‌های (Shaft) مختلفی (۸ تا ۳۸۴ کانال در دسترس) برای پیپت کردن نمونه‌ها در تعداد زیادی از چاهک‌ها به طور هم‌زمان، دارند. این پیپت‌ها با داشتن حداقل هزینه تولید و زمان تست در آزمایشگاه، بهره‌وری و خروجی را به میزان قابل توجهی افزایش می‌دهند.

پیپت چند کاناله مشابه میکروپیپت (Micropipette) تک کانالی یا پیپت معمولی است که در آزمایشگاه به خاطر کارکرد، اجزا و کارایی آن استفاده می‌شود. اما یک پیپت چند کاناله بهتر از یک پیپت تک کاناله در آزمایشگاه‌هایی است که به طور مکرر با مایعات یکسانی (شناساگرها/ نمونه‌ها) کار می‌کنند.

اجزای پیپت چند کاناله

اجزای پیپت چند کاناله دستی مانند میکروپیپت تک کاناله دستی بوده که به شرح ذیل می‌باشد:

• پلانجر (Plunger): دارای دو استاپ است، اولی برای مکش مایع و دومی برای توزیع مایع مکش شده.
• دکمه اجکتور سر سمپلر (Tip ejector button): فشار دادن این دکمه به خارج کردن یا برداشتن سرهای پیپت کمک می‌کند.
• پیچ تنظیم حجم (Volume adjustment knob): مانند میکروپیپت‌ها، پیپت‌های چند کانالی با امکان تنظیم حجم نیز موجود هستند. بنابراین، یک پیچ در نزدیکی پلانجر به تنظیم حجم مورد نظر کمک می‌کند.
• پنجره نمایش حجم دیجیتالی (Digital volume display window): این پنجره حجم پیپت را نمایش می‌دهد.
• شفت پلاستیکی (Plastic shaft): این شفت، ساختاری لوله مانند است که برای عوض کردن هوا در یک پیپت عوض کننده هوا استفاده می‌شود و نقش کولار (Collar) را برای خروج سر‌ها ایفا می‌کند.
• مخروط سر سمپلر (Tip cone): سر پیپت را نگه می‌دارد. تنها تفاوت این قسمت بین پیپت چند کاناله و تک کاناله در تعداد آن است. تک کاناله فقط یک مخروط سر سمپلر دارد، اما چند کاناله در محدوده 8 تا 18 مخروط سر سمپلر قرار دارد.
• سر پیپت (Pipette tip): قسمت‌هایی هستند که از پلی‌پروپیلن (Polypropylene) یک‌بار مصرف یا قابل اتوکلاو کردن، ساخته شده‌اند. سر پیپت به مخروط سر سمپلر متصل می‌شود و در تماس مستقیم با مایعی که قرار است مکیده شود، قرار می‌گیرد.

پیپت چند کاناله الکترونیکی تقریباً همان اجزای پیپت چند کاناله دستی را دارد. با این حال، به جای پیچ تنظیم حجم و پلانجر، پیپت چند کاناله الکترونیکی دارای دکمه‌هایی برای تغییر حجم و شروع فرآیند پیپت کردن است.

یک پیپت چند کاناله چگونه کار می‌کند؟

روش صحیح پیپت کردن برای رسیدن به دقت در جابجایی مایع ضروری است. نکات زیر را باید قبل از استفاده از پیپت چند کاناله در نظر بگیرید:

1. برای اطمینان از ایمنی شخصی از دستکش استفاده کنید.
2. حجم صحیح یا دلخواه را در یک پیپت کالیبره شده و به خوبی نگه‌داری شده، تنطیم کنید.
3. از یک پیپت تمیز استفاده کنید و مطمئن شوید که در ناحیه مخروط سر سمپلر انسدادی وجود ندارد.
4. هنگامی که پیپت آماده استفاده شد، سر پیپت را وصل کنید، پیپت را در وضعیت عمودی نگه دارید و از سر پیپت در یک جعبه استفاده کنید.
5. اطمینان حاصل کنید که سر پیپت محکم به پیپت چسبیده باشد.

روش‌های توزیع مایعات

دو روش متداول مورد استفاده عبارت است از تکنیک‌های پیپت کردن فوروارد (Forward pipetting) و معکوس (Backward) است.

پیپت کردن فوروارد

این روش برای مایعاتی که به راحتی کف نمی‌کنند یا در مقدار محدودی هستند، بهتر است. به پیپتینگ دقیق نیز معروف است.

1. قبل از فرو بردن سر پیپت در مایع، پلانجر را در استاپ اول فشار دهید.
2. هنگامی که سرهای پیپت را در ظرف فرو می‌برید، مطمئن شوید که به اندازه 1 سانتی‌متر در مایع فرو می‌رود است و تمام سرها در عمق یکسانی هستند.
3. پلانجر را رها کنید تا سرها پر شوند.
4. سرهای پیپت را به آرامی از لبه ظرف بیرون بکشید تا مایع اضافی خارج شود.
5. مراحل بالا را 1 تا 2 بار برای پیش مرطوب‌سازی یا آماده‎سازی سرها برای بیرون کشیدن مایع و توزیع حجم‌های مساوی از آن در همه کانال‌ها، تکرار کنید.
6. قبل از توزیع مایع در ظرف مورد نظر، سرهای پیپت را از نظر وجود حباب‌های هوا، پر شدن نامناسب یا نشتی بررسی کنید.
7. اگر حباب‌های هوا وجود داشت یا سر‌های پیپت به‌طور نامناسب پر شده بودند، مایع را خارج کنید و مکیدن مایع را تکرار کنید و اگر نشتی وجود داشت، سرها را دور بیندازید و سرهای جدیدی را دوباره وصل کنید.
8. برای توزیع مایع در چاهک‌های ظرف مورد نظر، سرهای پیپت را نزدیک به ته چاهک‌ها قرار دهید.
9. پلانجر را در استاپ اول فشار دهید، مکث کنید و سپس تا استاپ آخر فشار دهید. این عمل باعث پخش مایع می‌شود. در حالی که پلانجر پایین است با نگه داشتن سرهای پیپت در داخل چاهک، پیپت را به آرامی خارج کنید.
10. پلانجر را رها کرده و دکمه اجکتور را فشار دهید تا سرها جدا شوند.

پیپت کردن معکوس

این روش با عنوان تکنیک پر کردن بیش از حد (Overfilling technique) نیز شناخته می‌شود.

• تفاوت این روش با پیپت کردن فوروارد در فشار دادن پلانجر تا استاپ دوم قبل از فرو بردن در مایع است که باعث پر شدن بیش از حد مایع در سرها می‌شود.
• همچنین در حین توزیع مایع، پلانجر را تا اولین استاپ فشار دهید و مایع باقی‌مانده را دور بریزید.

کالیبراسیون پیپت (چند کانال و تک کانال)

کالیبراسیون فرآیند ارزیابی و اصلاح دقت و صحت هر وسیله‌ای، به ویژه دستگاه‌های اندازه‌گیری می‌باشد. به همین ترتیب، پیپت نیز هر از گاهی نیاز به کالیبراسیون دارد.

برای انجام روش صحیح کالیبره کردن پیپت به صورت دستی باید موارد زیر را بدانید:

مواردی که برای کالیبراسیون باید در نظر بگیرید

• دمای محیط کنترل شده
• میز ضد لرزش
• فشار کنترل شده
• شناخت تکنیک‌های مناسب پیپت
• محیط تمیز
• ترازو باید کالیبره شده و پایدار باشد.

تجهیزات مورد نیاز برای کالیبراسیون

• پیپت‌ها
• ترازوی نیمه میکرو
• آب مقطر
• نمودار چگالی آب در دماهای مختلف
• بشرهای آزمایشگاهی (Beaker) تمیز
• ماشین حساب یا نرم‌افزاری جهت محاسبه
• دفترچه یادداشت جهت ثبت اطلاعات

روش کالیبراسیون

طبق گفته دانشگاه فناوری تگزاس، آنالیز وزنی (Gravimetric analysis) برای کالیبره کردن پیپت ایده‌آل است. روش گام به گام کالیبراسیون به شرح زیر است:

1. آب را به مدت 15 تا 30 دقیقه در دمای اتاق نگه دارید تا محیطی با دمای کنترل شده بدست آورید. سپس دمای آب را ثبت کنید.
2. بشر آزمایشگاهی خالی و تمیز را در ترازوی تحلیلی قرار دهید و ترازو را روی 0 تنظیم کنید.
3. سپس پیپت مورد نیاز برای کالیبره شدن را بردارید و مطمئن شوید که مسدود نشده است و برای پیپت کردن آماده است.
4. آب را مکش کنید و مطمئن شوید که حباب هوا در حین آسپیراسیون (Aspiration) ایجاد نمی‌شود.
5. آب را در بشر آزمایشگاهی بریزید و وزن آب را اندازه بگیرید. سپس وزن را ثبت کنید.
6. مراحل دو تا پنج را 5 تا 10 بار تکرار کنید.
7. حجم آب توزیع شده را با استفاده از فرمول V= w ✕ Z محاسبه کنید، که در آن V حجم محاسبه شده است، w میانگین وزن آب پیپت شده و Z ضریب تبدیل بر اساس چگالی آب در دمای خاص است. از نرم‌افزار می‌توان در محاسبات استفاده کرد.
8. میانگین تعداد دفعاتی که آزمون انجام شده است، محاسبه می‌شود.
9. برای تعیین دقت پیپت از نرم‌افزار استفاده کنید. محاسبه دقت به صورت دستی نیز با استفاده از فرمول A = 100 ✕ Vavg/V0 امکان‌پذیر است، که در آن A برابر دقت، Vavg برابر حجم متوسط و V0 برابر مقدار اختصاص داده شده به پیپت است. دقت ایده آل باید بین 99 تا 101٪ باشد.
10. نتیجه را ثبت کنید؛ اگر مقدار آن بین 99٪ و 101٪ باشد، پیپت آماده استفاده است.

کالیبراسیون پیپت چند کاناله مانند پیپت تک کاناله است. مکانیزم پلانجر مرکزی برای فعال کردن همه کانال‌ها به طور هم‌زمان به روشی ثابت استفاده می‌شود. با این حال، این فرآیند در آزمایشگاه استاندارد پیچیده می‌شود، بنابراین بهتر است با شرکت‌هایی که خدمات کالیبراسیون برای پیپت چند کاناله ارائه می‌دهند، تماس بگیرید.

تفاوت بین پیپت تک و چند کاناله

• یک پیپت تک کاناله برای افزایش کارایی در آزمایشگاهی که آزمون‌های بزرگتری مانند ELISA 96 چاهکی (96 well ELISA) را انجام می‌دهد ایده‌آل نیست. پیپت کردن از یک تک کاناله نیازمند تکرار دوباره و دوباره همان کار است.
• ظرفیت پیپت تک کاناله 0.1 تا 10000 میکرولیتر و پیپت چند کاناله دارای ظرفیت حجمی 0.5 تا 1000 میکرولیتر است.
• چند سال پیش، یک پیپت چند کاناله به دلیل مشکل در استفاده، در مکش مایع در کانال‌های مختلف دارای عدم دقت بود. با این حال، این موضوع توسط پیپت نسل جدید به خوبی مدیریت می‌شود.
• کالیبراسیون پیپت چند کاناله نسبت به پیپت تک کاناله زمان‌برتر و خسته کننده‌تر است.
• پیپت چند کاناله به کاهش قابل توجه خطای انسانی به دلیل تکرار کمتر پیپت کردن، کمک می‌کند.
• تعمیر برخی از پیپت‌های چند کاناله غیرممکن است زیرا اگر یک کانال از پیپت آسیب ببیند، کل سیستم نیاز به تغییر دارد.

پیپت‌های چند کاناله موجود

بسیاری از شرکت‌ها پیپت‌های چند کاناله مختلفی را با برخی ویژگی‌های متمایز ارائه می‌کنند. در جدول زیر نام شرکت، پیپت و اجزای آن آورده شده است:

شرکت	پیپت چند کاناله	امکانات
Thermo Fisher Scientific	الکترونیکی: E1-Clip Tip و Finnpipette دستی: F1-Clip Tip، Finnpipette F1 و Finnpipette F2.	E1-Clip Tip با مایع خروجی 15 تا 1250 میکرولیتر سازگار است و دارای هشت کانال و فاصله سر قابل تنظیم است. Finnpipette دستی دارای 12 کانال است و می‌تواند 5 تا 50 میکرولیتر مایع را خارج کند. Finnpipette الکترونیکی دارای هشت کانال است و می‌تواند 100 تا 1000 میکرولیتر مایع را جابجا کند. F1-Clip Tip دستی دارای 12 کانال است و می‌تواند 30 تا 300 میکرولیتر را برداشت کند.
Gilson	دستی: MyPIPETMAN الکترونیک: PIPETMAN	MyPIPETMAN دارای دو نوع بر اساس تعداد کانال (8 و 12) است و حجم پیپت در محدوده 0.5 تا 300 میکرولیتر است. PIPETMAN به بلوتوث متصل است و دارای 8 تا 12 کانال و پیپت با حجم 0.5 تا 1200 میکرولیتر است.
Eppendorf	دستی: Eppendorf Reference 2	این پیپت دارای 8 تا 12 کانال می‌باشد و ظرفیت 0.5تا1000 میکرولیتر دارد.
Mettler Toledo	Rainin Pipettes دستی: PIPET Lite الکترونیکی: E4 MultiPipette	PIPET Lite در طیف گسترده‌ای از ظرفیت‌ها (0.5 تا 1200 میکرولیتر) و 8 تا 12 کانال موجود است. تنوع محصول E4 MulitPipette با PIPET Lite دستی یکسان است.
Sartorius	دستی: Tacta الکترونیک: Picus و Picus Nxt	Tacta در 8 تا 12 کانال موجود است و می‌تواند از 0.5 تا 1200 میکرولیتر ظرفیت داشته باشد.
Integra Biosciences	الکترونیک دستی: Viaflo، Voyager و MINI 96	Viaflo با کانال‌های زیاد، از 4 تا 384 کانال موجود است. این کانال‌ها با داشتن دسته سر پیپت به جلوگیری از افتادن ته آن در حین پیپت کردن کمک می‌کنند. MINi 96 در مدل‌های 96 و 384 کاناله موجود است. این پیپت مقرون به صرفه است. Voyager هم 96 و 384 کانال دارد. همچنین دارای قابلیت تنظیم خودکار فضای سر پیپت است.

همچنین بخوانید:

• سمپلر چیست؟
• تجهیزات مورد استفاده در آزمایشگاه میکروبیولوژی
• لوله های اپندورف

تجهیزات مورد استفاده در آزمایشگاه میکروبیولوژی

آزمایشگاه میکروبیولوژی با کشت و شناسایی میکروارگانیسمهایی مانند باکتری‌ها، قارچها، ویروسها و غیره سر و کار دارد. برخی از الزامات آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی عبارتند از تجهیزات یا ابزارهای ضروری، منابع انسانی آموزش دیده، حفظ ایمنی شخصی، بهداشت محیط کار، نظم و تعمیر و نگهداری تجهیزات.

تجهیزاتی که معمولاً در آزمایشگاه میکروبیولوژی استفاده می‎‏شوند:

نیروی انسانی در کنار تجهیزات، کار هر آزمایشگاهی را بدون دردسرتر می‎‏کند. تجهیزات و ابزار زیادی برای آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی وجود دارد. برخی از آنها به شرح زیر است:

فهرست تجهیزات مورد استفاده در آزمایشگاه میکروبیولوژی:

1. اتوکلاو
2. آون
3. زباله سوز
4. زباله سوز باکتریایی
5. ترازو آنالیتیکال
6. هود ایمنی بیولوژیکی
7. چراغ بونزن
8. سانتریفیوژ
9. ابزارهای کروماتوگرافی
10. کلنی کانتر
11. دستگاه الکتروفورز ژل
12. هموژنایزر
13. هات پلیت
14. انکوباتور
15. فریزر آزمایشگاهی
16. هود لامینار
17. میکروسکوپ
18. میکروپیپت
19. ترمال سایکلر یا PCR
20. PH متر
21. یخچال
22. اسپکتروفتومتر
23. میکسرهای ورتکس
24. بن ماری
25. ابزارهای سرولوژیکی
26. دیسپنسر دیسک آنتی بیوتیک
27. Antibiotic zone reader
28. چگالی سنج
29. بشر
30. ارلن
31. میله شیشه‌ای
32. استوانه مدرج
33. لام میکروسکوپی
34. پتری دیش
35. پیپت شیشه‌ای
36. لوله آزمایش
37. محیط های کشت
38. لوله‌های اپندورف
39. لوپ و سوزن تلقیح
40. حمام خشک

تجهیزات مورد استفاده برای استریل کردن

اتوکلاو

 

اتوکلاو نمونه‌ای از استریلیزاسیون با حرارت مرطوب است و بخار تحت فشار بالای 100 درجه سانتیگراد برای استریل کردن استفاده می‎‏شود. هدف اصلی اتوکلاو استریل کردن محیط کشت و لوازم آزمایشگاهی است. اتوکلاوهای زیادی وجود دارد اما رایج‌ترین نوع، اتوکلاو آزمایشگاهی است.

آون

آون با هوای گرم حرارت خشک را برای استریل کردن اعمال می‎‏کند. کاربرد اصلی آن استریل کردن ظروف شیشه‌ای مانند پیپت، ارلن، ابزار فلزی و قیچی است. جریان الکتریکی گرما را در آون تامین می‎‏کند. گرما به دلیل چیدمان عناصر گرمایشی به طور یکنواخت تامین می‎‏شود. زمان نگهداری بستگی به دما دارد.

زباله سوز

یک آزمایشگاه میکروبیولوژی بالینی زباله‌های خطرناکی تولید می‎‏کند که باید به طور مناسب از بین بروند که زباله سوز بهترین راه برای از بین بردن این مواد خطرناک است. کوره‌های زباله سوز از گرما برای از بین بردن جامدات استفاده می‎‏کنند. این ابزار بهترین جایگزین برای دفع است زیرا می‎‏تواند مقادیر زیادی زباله را در یک زمان از بین ببرد.

زباله سوز باکتریایی

جزو تجهیزات آزمایشگاه میکروبیولوژی است که برای استریل کردن استفاده می‎‏شود. این ابزار از دمای بالا برای استریل ظروف فلزی کوچک مانند لانست، سوزن، لوپ های تلقیح و فورسپس استفاده می‎‏کند. به زمان کمتری نیاز دارد و می‎‏تواند جایگزین مناسبی برای چراغ های Bunsen و لامپ های الکلی باشد.

ابزار کشت و تشخیصی

ترازو آنالیتیکال

ترازوی تحلیلی جرم اجسام جامد، مایعات و پودرها را اندازه‌گیری می‎‏کند. نوعی دستگاه الکترونیکی است و دقت آن 0.0001 گرم است.

هود ایمنی بیولوژیکی

یک آزمایشگاه میکروبیولوژی با بسیاری از ارگانیسم‌های عفونی و خطرناک و مواد شیمیایی سرطان‌زا سر و کار دارد. خطر آلودگی محیط زیست و پرسنل آزمایشگاه میکروبیولوژی بسیار زیاد است بنابراین نیاز به انتقال ایمن و بدون آلودگی نمونه‌ها، پدید آمده است. کابینت ایمنی بیولوژیکی اصلی ترین وسیله‌ای است که برای مهار نمونه‌های میکروبیولوژیکی استفاده می‎‏شود.

کابینت‌ها بسته به نوع ارگانیسم‌های مورد استفاده در آزمایشگاه به سطوح مختلفی تقسیم می‎‏شوند. سطوح ایمنی زیستی (BSL) شرایطی را برای جابجایی ایمن با ارگانیسم فراهم می‎‏کند. چهار سطح مختلف ایمنی زیستی وجود دارد. BSL1، BSL2، BSL3 و BSL4. BSL4 خطرناک ترین ارگانیسم‌هایی که باعث بیماری‌های تهدید کننده می‎‏شوند را کنترل می‎‏کند، در حالی که BSL1 ارگانیسم‌هایی را کنترل می‎‏کند که می‎‏توانند باعث عفونت‌های خفیف شوند.

چراغ بونزن

اجزای چراغ بونزن

چراغ Bunsen یک مشعل گازی است که از حرارت خشک برای استریل کردن مواد استفاده می‎‏کند. بالاترین دمایی که می‎‏تواند ایجاد کند، 1870 درجه سانتیگراد است. مواد را با نگه داشتن (تقریباً عمودی) در شعله حرارت می‌دهد تا داغ شوند. چراغ Bunsen معمولاً به گاز نیاز دارد. استفاده از چراغ Bunsen برای ضدعفونی کردن موادی مانند سوزنهای تلقیح، نوک فورسپس و اسپاتول است. از چراغ Bunsen می‎‏توان برای شعله ور کردن دهانه لوله‌های آزمایش و ارلن قبل و بعد از استفاده و حذف حباب‌های گازی ایجاد شده در هنگام ریختن محیط، استفاده کرد.

سانتریفیوژ

سانتریفیوژ وسیله‌ای آزمایشگاهی است که به جداسازی سیالات، گازها یا مایعات بر اساس چگالی آنها کمک می‎‏کند. چرخاندن ظرف حاوی مواد با سرعت بالا باعث جداسازی می‎‏شود. کاربرد این تجهیزات در بسیاری از آزمایشگاه‌ها برای جداسازی سلولها، اندامکهای درون سلولی، ویروسها، پروتئینها و اسیدهای نوکلئیک می‌باشد. سانتریفیوژ سرعت بالای نیروی گریز از مرکز ایجاد می‎‏کند. سانتریفیوژ بر اساس کاربرد یا موتور انواع مختلفی دارد از جمله سانتریفیوژهای رومیزی، سانتریفیوژهای رومیزی یخچالی، سانتریفیوژهای رومیزی بالینی، میکروسانتریفیوژها و سانتریفیوژهای خلاء.

ابزارهای کروماتوگرافی

کروماتوگرافی تکنیکی است که به جداسازی و تجزیه و تحلیل مخلوط‌های پیچیده کمک می‎‏کند. از یک فاز متحرک تشکیل شده است که مخلوط را حمل می‎‏کند و آن را به فاز ساکن منتقل می‎‏کند.

سرعت حرکت مواد به دلیل تفاوت در میزان حرکت، متفاوت است. تجهیزات کروماتوگرافی شامل ستونها، فریت‌ها، سلولهای جریان، پمپ‌ها، آشکارسازها، کلکتورها و سیستم‌های کامل مورد استفاده در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، کروماتوگرافی گازی (GC) و کروماتوگرافی مایع-طیف سنج جرمی (LC-MS) می‌باشد.

شمارنده کلنی یا کلنی کانتر

شمارنده کلنی دستگاهی است که به طور خودکار کلنی‌ها را در پلیت آگار شمارش می‎‏کند. از برچسب‍های فلورسنت یا کاننتراست نواحی روشن و تاریک روی پلیت، برای اندازه گیری کلنی‌ها استفاده می‎‏کند. در اکثر آزمایشگاه‌ها جایگزین روش شمارش مرسوم(شمارش دستی) شده است.

دستگاه الکتروفورز ژل

الکتروفورز فرآیندی است که اسید نوکلئیک و پروتئین را بر اساس اندازه و بار آنها جدا می‎‏کند. به مجموعه‌ای از انواع مختلف دستگاه‌ها و تجهیزات نیاز دارد. دو نوع اصلی از الکتروفورز موجود است شامل الکتروفورز افقی و عمودی. هر دو نوع تقریباً به یک مجموعه از ابزار نیاز دارند. تفاوت این است که نمونه‌ها در نوع عمودی در بالای ژل و در نوع افقی در چاه در یک طرف ژل لود می‎‏شود. الکتروفورز ژل عمودی بهتر است زیرا می‎‏تواند قطعات کوچکتر DNA و نمونه‌‎های زیادی را در یک زمان پردازش کند.

SDS PAGE نوعی تکنیک الکتروفورز است که از آن برای جداسازی پروتئین ها استفاده می‌شود.

الکترودها، محفظه‌های الکتروفورز، سینی الکتروفورز، پلی آکریل آمید، آگارز، بافرها و شانه ابزارهای لازم برای الکتروفورز هستند.

هموژنایزر

هموژنایزر ابزاری است که به بدست آوردن یک مخلوط یکنواخت و یکدست کمک می‎‏کند. هموژنایزر اجزا را تجزیه می‎‏کند تا توزیع در سراسر محلول یکنواخت باشد. ماده موجود در مخلوط یا غیرقابل اختلاط است یا اندازه‌های متفاوتی دارند یا در فازهای متمایز از یکدیگر هستند. علاوه بر همگن کردن محلول، این ابزار در امولسیون کردن، آسیاب کردن، پراکندگی و حل کردن مواد عمل می‎‏کند.

هات پلیت

هات پلیت، به محلولها و مواد به طور یکنواخت گرما می‌دهد. بسیار ایمن‌تر از چراغ Bunsen است زیرا شعله باز در هات پلیت وجود ندارد. در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی، هات پلیت برای ساخت محیط‌های آگار و محیط‌های بیوشیمیایی استفاده می‎‏شود. بر اساس موادی که برای ساخت هات پلیت استفاده می‎‏شود، انواع مختلفی دارد. برخی از موادی که بیشتر در ساخت هات پلیت استفاده می‎‏شود آلومینیوم، شیشه و سرامیک است.

در اینجا، آلومینیوم رسانای خوبی برای گرما است و هات پلیت به سرعت و به طور یکنواخت گرم می‎‏شود، اما پس از گرم کردن مواد خورنده، مستعد زنگ زدگی و تخریب است. اما سرامیک به دلیل رنگ روشن مواد در برابر خوردگی و مشاهده نمونه مقاوم است. اما اگر به طور اشتباه استفاده شود، ممکن است ترک بخورد. به همین ترتیب، مواد شیشه‌ای نیز در برابر خوردگی مقاوم هستند، به طور موثر گرم می‎‏شوند و مشاهده نمونه‌ها آسان است. علاوه بر این، شیشه شانس انتقال گرما به خارج از شیشه را کاهش می‌دهد و سوختگی را کاهش می‌دهد.

انکوباتور

انکوباتور ابزاری است که دمای مورد نظر برای کشت آزمایشگاهی میکروارگانیسم‌ها را فراهم می‎‏کند. این شامل یک محفظه دو جداره است که از ورقه‌های فلزی تشکیل شده است. قسمت جلوی اتاقک دارای در شیشه‌ای است. ترموستات دمای انکوباتور را کنترل می‎‏کند و منبع گرما را تا زمانی که انکوباتور به دمای مورد نیاز برسد، خاموش می‎‏کند. همچنین دارای یک دماسنج است که دما را ثبت می‎‏کند. انواع مختلفی از انکوباتورها در میکروبیولوژی استفاده می‎‏شود. آنها انکوباتورهای رومیزی، انکوباتورهای CO2، شیکر و خنک کننده هستند.

فریزر آزمایشگاهی

فریزر آزمایشگاهی برای نگهداری نمونه‌ها و سایر مواد در دمای 10- تا 30- درجه سانتیگراد استفاده می‎‏شود. فریزر آزمایشگاهی معمولاً می‎‏تواند نمونه‌ها را تا 25- درجه سانتیگراد ذخیره کند در حالی که فریزرهای با دمای بسیار پایین می‎‏توانند نمونه‌ها را تا 80- درجه منجمد کنند.

هود لامینار

هود لامینار نوعی کابین ایمن است و دارای جریان هوای یک طرفه است که با سرعت ثابت در امتداد خطوط موازی حرکت می‎‏کند. هود لامینار را می‎‏توان در آزمایشگاه‌هایی استفاده کرد که خطر دست زدن به ارگانیسم‌های خطرناک، به طور قابل توجهی، کم باشد. فیلتر HEPA (با راندمان بالا) ذرات از جمله میکروارگانیسم‌ها را از هوا حذف می‎‏کند. هدف این محفظه تهیه محیط استریل و مونتاژ محیط‌ها و انتقال مواد به صورت آسپتیک است.

میکروسکوپ

اکثر میکروارگانیسم‌ها با چشم غیر مسلح قابل مشاهده نیستند. میکروسکوپ یک ابزار نوری است که از یک عدسی یا ترکیبی از عدسی‌ها تشکیل شده است که تصویر بزرگ شده‌ای از اجسام کوچک می‌سازد. دو نوع میکروسکوپ بسته به اصل آنها وجود دارد شامل میکروسکوپ نوری و میکروسکوپ الکترونی. میکروسکوپ نوری شامل چهار نوع میدان روشن، میدان تاریک، فلورسانس و فاز کنتراست است.

در مقابل، یک میکروسکوپ الکترونی تنها به دو نوع تقسیم می‎‏شود: میکروسکوپ الکترونی گذاره و میکروسکوپ الکترونی نگاره. میکروسکوپ دارای قسمت‌های مختلفی است: عدسی چشمی، کندانسور، عدسی شیئی، دیافراگم، منبع نور و پیچ‌های تنظیم ماکرو و میکرو.

میکروپیپت

میکروپیپت‌ها ابزارهای نیمه اتوماتیکی هستند که از نوک پیپت یکبار مصرف برای بیرون کشیدن و توزیع نمونه مایع استفاده می‎‏کنند که به جلوگیری از خطر آلودگی انسانی در آزمایشگاه و همچنین اندازه گیری دقیق معرف و نمونه کمک می‎‏کند.

ترموسایکلر یا PCR

ترموسایکلرها ابزاری هستند که به تکثیر نمونه‌های DNA و RNA با فرآیند واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) کمک می‌کنند. ترموسایکلر دمای نمونه‌ها را در یک بلوک نگهدارنده با مراحل از پیش برنامه ریزی شده، کنترل می‎‏کند. سپس امکان دناتوره شدن و واسرشت نمونه‌ها با معرف‌های مختلف را فراهم می‎‏کند و بعد ژن تکثیر شده را می‎‏توان در کلونینگ، توالی یابی، آنالیز نمونه و ژنوتیپ استفاده کرد.

PH متر

PH متر میزان اسیدیته یا قلیایی بودن محلول را اندازه گیری می‎‏کند و فعالیت یون‌های هیدروژن را در محلول تشخیص می‌دهد. درجه فعالیت یون‌های هیدروژن در محلول، سطح pH محلول است، یعنی هر چه فعالیت یونهای هیدروژن بیشتر باشد، سطح pH محلول بالاتر است.

یخچال

یخچال محیطی با دمای پایین فراهم می‎‏کند و آن دسته از مواد و محیط کشتهایی را که ممکن است در دمای اتاق تجزیه و از بین بروند، نگهداری می‎‏کند. رایج‌ترین یخچال مورد استفاده، یخچال خانگی با مساحت 1-2 متر مکعب یا حتی بزرگتر است. دمای ایده آل 4-5 درجه سانتیگراد است و برخی از یخچال‌ها ممکن است دارای فریزرهایی باشند که 20- تا 40- درجه سانتیگراد را ایجاد می‎‏کنند. استفاده از یخچال برای نگهداری کشت‌ها، محیطهای آماده شده، خون، سرم، آنتی بیوتیکها و سایر مواد شیمیایی است.

اسپکتروفتومتر

اسپکتروفتومتر ابزاری است که تعداد فوتون‌های جذب شده را پس از عبور از محلول نمونه اندازه گیری می‎‏کند. اسپکتروفتومتر بر اساس طول موج منبع نور دو نوع است: اسپکتروفتومتر مادون قرمز و UV.

اسپکتروفتومتر از دو قسمت تشکیل شده است: طیف سنج و نور سنج. طیف سنج، نوری با طول موج مورد نظر تولید می‎‏کند. هم زمان، فتومتر تعداد فوتون‌‎های جذب شده توسط محلول را تشخیص داده و مقدار آن را نشان می‌دهد.

میکسرهای ورتکس

میکسر ورتکس نمونه‌های آزمایشگاهی را مخلوط می‎‏کند. یک محور محرک موتوری در زیر سطح نمونه وجود دارد که به سرعت نوسان می‎‏کند و حرکت مداری را به ظرف نمونه بارگذاری شده در میکسر منتقل می‎‏کند. این حرکت باعث می‎‏شود که نمونه به گردش درآید و تحت یک جریان متلاطم قرار گیرد که به عنوان ورتکس شناخته می‎‏شود و مزیت آن اختلاط نمونه‌ها در ظرف دربسته است و اختلاط حداقل دو نمونه در یک زمان امکان پذیر است.

حمام آب گرم (بن ماری)

حمام آب گرم ابزاری است که دمای ثابتی را برای نمونه فراهم می‎‏کند و ترموستات دما را کنترل می‎‏کند. این دستگاه شامل یک جعبه عایق از فولاد و الکترود برای تامین گرما است. کاربرد آن در میکروبیولوژی برای انکوباتور، آماده سازی محیط و حفظ دما است.

ابزارهای سرولوژیکی

شناسایی میکروب نیز مستلزم انجام آزمایشات سرولوژیکی به ویژه برای تشخیص ویروس‌ها است. ابزارهای زیر برای آزمایشات سرولوژیکی مورد نیاز است:

کیت تست الایزا

کیت الایزا (آزمایش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم) با معرف‌های مورد نیاز برای آزمایش، پلیتهای با چاه‌های متعدد (از قبل پوشش داده شده با آنتی بادی/آنتی ژن جذب شده) و بافر برای انجام آزمایش ارائه می‎‏شود.

نمایشگر الایزا

ابزار آزمایشگاهی است که پس از انجام الایزا به خواندن فلورسانس، لومینسانس یا واکنش کروموژنیک کمک می‎‏کند.

ابزار تست حساسیت آنتی بیوتیکی

دیسپنسر دیسک آنتی بیوتیک

به قرار دادن دقیق دیسک آنتی بیوتیک در محیط انتخابی کمک می‎‏کند و کاربرد آن برای به دست آوردن دقت در حین انجام آزمایش حساسیت آنتی بیوتیکی است. بر اساس تعداد کارتریج و اندازه صفحه پتری در انواع مختلفی موجود است.

Antibiotic Zone Reader

به خواندن دقیق قطر منطقه مهار آنتی بیوتیک مورد استفاده کمک می‎‏کند. این یک روش خودکار است که جایگزین کار خسته کننده دستی و اشتباه خوانش منطقه مهار در طول آزمایش حساسیت آنتی بیوتیکی می‎‏شود.

چگالی سنج یا Densitometer

روش Kirby Bauer برای تست حساسیت آنتی بیوتیکی نیاز به غلظت استاندارد (استاندارد مک فارلند) کلنی‌های باکتریایی دارد. چگالی سنج یک ابزار آزمایشگاهی خودکار است و در به دست آوردن غلظت مورد نیاز سوسپانسیون باکتریایی کمک می‎‏کند.

ظروف شیشه‌ای

بشر، ارلن، میله‌های شیشه‌ای، اسلاید میکروسکوپی، پتری دیش، پیپت شیشه‌ای و لوله‌های آزمایش رایج ترین ظروف شیشه‌ای مورد استفاده در آزمایشگاه میکروبیولوژی هستند.

بشر

بشر ظرفی شیشه‌ای است که کف آن صاف است. استفاده از بشر در آزمایشگاه میکروبیولوژی برای نگهداری یا ذخیره مایعات است.

ارلن (فلاسک مخروطی)

نوعی فلاسک مخروطی شکل با انتهای گرد و صاف و گردن استوانه‌ای شکل است که به آن ارلن نیز می‌گویند. هدف آن در آزمایشگاه میکروبیولوژی تهیه محیط است.

میله شیشه‌ای

برای مخلوط کردن مواد شیمیایی و مایعات استفاده می‎‏شود و از شیشه جامد با ضخامت و طولی شبیه به نی نوشیدنی ساخته شده‌اند و دارای انتهای گرد است. میله‌های شیشه‌ای خمیده یا میله‌های L شکل نمونه‌های رقیق را روی سطح آگار پخش می‎‏کنند، در حالی که از میله‌های شیشه‌ای مستقیم برای هم زدن آگار و محلول استفاده می‎‏شود.

استوانه مدرج

وسیله‌ای از شیشه یا پلاستیک است که برای اندازه‌گیری حجم مایعات مختلف استفاده می‎‏شود. استوانه مدرج دارای درجه بندی است و حجم را بر حسب میلی لیتر (میلی لیتر) اندازه گیری می‎‏کنند.

اسلاید (لام) میکروسکوپی

آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی از انواع مختلف اسلایدهای میکروسکوپی استفاده می‎‏کنند و در رنگ آمیزی و مشاهده زیر میکروسکوپ استفاده می‎‏شود. ابعاد ترجیحی اسلاید شیشه‌ای ساده، سه در یک اینچ با ضخامت 1 میلی متر است. نوع دیگری از لام، دارای چاه یا فرورفتگی در مرکز است.

پتری دیش

پتری دیش از شیشه و یا پلاستیک ساخته شده است و در آن محیط کشت ریخته می‎‏شود و محیطی مناسب برای رشد میکروارگانیسمها فراهم می‎‏کند. پتری از دو قسمت شبیه به هم تشکیل شده است، اما یکی بزرگتر از دیگری است و ساختاری کلاهک مانند را تشکیل می‌دهد. قطر مطلوب پتری دیش 90 میلی متر است.

پیپت شیشه‌ای

پیپت ظرف شیشه‌ای است که به رساندن مقدار مشخصی مایع از یک ظرف به ظرف دیگر کمک می‎‏کند. پیپت لوله شیشه‌ای مدرج است که علامت گذاری شده است و نمونه از طریق کاپیلاری کوچکی کشیده می‎‏شود.

لوله آزمایش

لوله آزمایش استاندارد کاربرد زیادی در آزمایشگاه میکروبیولوژی دارد. با فراهم کردن نوعی محیط مصنوعی، تهیه کشت‌های ذخیره شده و انجام آزمایش‌های مختلف بیوشیمیایی به رشد میکروارگانیسمها کمک می‎‏کند. کاربران آزمایشگاه میکروبیولوژی از شیشه بوروسیلیکات استفاده می‎‏کنند که انتهای باز آن ساده و بدون لبه است و دارای درپوشهایی هستند، ضمنا استفاده از درپوش‌های فلزی یا پلاستیکی نیز امکان پذیر است.

محیطهای بیوشیمیایی

محیطهای بیوشیمیایی نوعی محیط یا محلول منحصر به فرد هستند که به مطالعه ویژگی‌های بیوشیمیایی هر میکروارگانیسم کمک می‎‏کند. مطالعه صفات بیوشیمیایی برای شناسایی میکروارگانیسم‌ها به ویژه باکتری‌ها ضروری است.

محیط کشت

مواد غذایی مصنوعی برای کشت باکتری و قارچ‌ها هستند و بر اساس حالت فیزیکی، ترکیب شیمیایی و کاربرد مورد نظرشان طبقه بندی می‎‏شوند.

بر اساس وضعیت فیزیکی، سه نوع محیط کشت وجود دارد. جامد، مایع و نیمه جامد. به طور مشابه، بر اساس ترکیب شیمیایی، دو نوع محیط کشت وجود دارد. مصنوعی و غیر مصنوعی. در نهایت، بر اساس استفاده مورد نظر، هفت نوع محیط کشت وجود دارد : محیطهای چند منظوره، انتخابی، افتراقی، محیط‌های غنی سازی، غنی شده، انتقال و محیطهای کشت بی‌هوازی.

لوله‌های اپندورف

لوله‌های اپندورف لوله‌های تک منظوره‌ای هستند که از پلی پروپیلن ساخته شده‌اند و کاربرد آنها سانتریفیوژ کردن، حمل و نقل، مخلوط کردن و ذخیره نمونه‌ها و معرف‌های مایع/جامد است.

لوپ و سوزن تلقیح

رشد میکروبی را از ظرفی به ظرف دیگر بدون وارد کردن ارگانیسم‌های ناخواسته منتقل می‎‏کنند. هر دو نوع شامل یک دسته چوبی متصل به سیم نیکروم یا فولاد ضد زنگ است که ممکن است به صورت حلقه(لوپ) یا مستقیم(سوزن) باشد.

در پایان، علاوه بر ابزارهای ذکر شده در بالا، تجهیزات ایمنی مانند دستکش، پیش بند آزمایشگاهی، روپوش و … برای جابجایی نمونه‌ها ضروری است.

حمام خشک

حمام خشک نوعی از تجهیزات آزمایشگاهی است که در گرم کردن چندین نمونه نگهداری شده در لوله‌های آزمایش مختلف کاربرد دارد. می‎‏تواند دیجیتال یا آنالوگ باشد. بر اساس بلوک‌هایی که لوله آزمایش را نگه می‌دارند، در اندازه‌های مختلف موجود است.

همچنین بخوانید:

• بن ماری (حمام آب گرم) چیست؟
• محیط کشت چیست؟ آشنایی با انواع محیط کشت و کاربرد
• pH متر چیست و 12 مطلب کلیدی درباره آن
• ترمال سایکلر (PCR)
• هود لامینار چیست؟ معرفی و بررسی
• اتوکلاو چیست؟

مترجم: معصومه قریبی ششده

استانداردهای مک‌فارلند: اصول، آماده‌سازی، موارد استفاده و محدودیت‌ها

استاندارد مک‌فارلند چیست؟

استانداردهای مک‌فارلند به عنوان مرجعی برای تنظیم کدورت سوسپانسیون مایع / باکتریایی در ویال یا لوله در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی استفاده می‌شوند. این استانداردها به حفظ و/ یا اطمینان از این‌که تعداد باکتری‌ها در محدوده معینی باشند تا تست‌های میکروبی استاندارد شوند، کمک می‌کنند.

این استانداردها را می‌توان با غلظت‌های متفاوتی از غلظت 0.5 تا 4 تهیه کرد و بسته به غلظت، تراکم تعداد سلول‌ها متفاوت است. با این حال، رایج‌ترین غلظت مورد استفاده برای تست حساسیت ضد میکروبی و آزمایش کارایی محیط کشت معمولاً با استاندارد 0.5 مک‌فارلند در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژیکی انجام می‌شود.

اصول استانداردهای مک‌فارلند

استاندارد مک‌فارلند یک محلول شیمیایی از کلرید باریم (Barium chloride) و اسید سولفوریک (Sulfuric acid) است. واکنش شیمیایی بین این دو ماده شیمیایی منجر به تولید یک رسوب نازک از سولفات باریم (Barium sulfate) می‌شود. پس از خوب تکان دادن آن، کدورت یک استاندارد مک‌فارلند از نظر بصری با یک سوسپانسیون باکتریایی با غلظت شناخته شده، قابل مقایسه است.

استانداردهای کدورت مک‌فارلند با مخلوط کردن حجم‌های مختلف اسید سولفوریک 1 درصد و کلرید باریم 1 درصد برای به دست آوردن محلول‌هایی با چگالی نوری خاص تهیه می‌شوند. با تنظیم حجم این دو شناساگر شیمیایی، استانداردهای مک‌فارلند با درجات مختلف کدورت که نشان دهنده تراکم باکتریایی یا تعداد سلول‌های مختلف است، را می‌توان تهیه کرد.

استاندارد کدورت 0.5 مک‌فارلند یک چگالی نوری قابل مقایسه با چگالی سوسپانسیون باکتریایی با واحدهای تشکیل کلنی ((Colony-forming unit) برابر 10⁸ × 1.5 (CFU/ml) ارائه می‌دهد.

استاندارد مک‌فارلند	1٪ BaCl2 (ml)	1% H2SO4 (ml)	تراکم تقریبی تعداد سلول (108 × سلول)
0.5	0.05	9.95	108 × 1.5
1.0	0.1	9.9	108 × 3.0
2.0	0.2	9.8	108 × 6.0
3.0	0.3	9.7	108 × 9.0
4.0	0.4	9.6	108 × 12.0

تهیه استانداردها

1. محلول کلرید باریم بی‌آب 1% (BaCl2) و محلول اسید سولفوریک 1% (H2SO4) را آماده کنید.
2. محلول‌های کلرید باریم و اسید سولفوریک را با هم ترکیب کرده و کاملاً مخلوط کنید تا یک سوسپانسیون کدر تشکیل شود.
3. مخلوط حاصل را در یک لوله آزمایشگاهی درپوش پیچ‌دار پوشیده با فویل قرار دهید.
4. استاندارد مک فارلند را زمانی که استفاده نمی‌کنید در دمای اتاق (25 درجه سانتی‌گراد) نگه‌داری کنید. محلول چگال استاندارد مک‌فارلند به مرور زمان رسوب می‌کند و توده تشکیل می‌دهد. پس قبل از هر بار استفاده نیاز به هم زدن شدید (با ورتکس (Vortex)) یا تکان دادن دارد. توجه: لوله را برای نشان گذاری سطح مایع علامت بزنید و قبل از استفاده بررسی کنید که تبخیر نشده باشد.
5. در صورت وجود نور خوب، کدورت را با نگه داشتن نمونه باکتریایی و لوله‌های استاندارد مک‌فارلند در مقابل نوارهای سیاه و سفید چاپ شده روی کارت به صورت بصری مقایسه کنید.
6. در صورت کدورت شدید، کدورت رشد سوسپانسیون باکتریایی را با افزودن براث (Broth) یا محلول نمکی (Saline) به وسیله پیپت (Pipette) استریل تنظیم کنید تا کدورت آن را با استاندارد مک‌فارلند هم‌ارز تطبیق دهید.
7. اگر سوسپانسیون آزمایشی خیلی روشن بود، با ارگانیسم‌های اضافی آن تلقیح کنید یا لوله‌ها را تا زمانی که کدورت با استاندارد تطابق پیدا کند، تلقیح کنید.

موارد استفاده

1. این استانداردها در پروسه تست حساسیت ضد میکروبی استفاده می‌شوند که در آن سوسپانسیون باکتریایی با استاندارد مک فارلند، قبل از استفاده از سواب (Swab) بر روی محیط MHA مقایسه می‌شود.
2. این استاندادها بخشی از فرایند کنترل کیفیت برای بررسی و تنظیم تراکم سوسپانسیون باکتریایی است که می‌تواند برای پروسه شناسایی و حساسیت استفاده شود.

محدودیت‌ها

1. در مورد محیط‌های رنگی، ممکن است کنتراست مناسبی با استانداردهای مک‌فارلند معادل ارائه ندهد و منجر به وقوع نتایج نادرست یا تراکم‌های نادرست شود.
2. کشت‌های قدیمی‌تر (بیش از 24 ساعت) سوسپانسیون‌های باکتریایی ممکن است با تعداد باکتری‌های مورد انتظار مقایسه نشوند.
3. استانداردهای مک‌فارلند توسط آنالیز اسپکتروفتومتر (Spectrophotometer) تنظیم شده است. استفاده از هر ابزار دیگری ممکن است نتایج قابل اعتمادی را در طول فرآیند آزمایش به همراه نداشته باشد.
4. در حین استفاده از استاندارد لاتکس (Latex)، لوله‌های سوسپانسیون باید به اندازه لوله استاندارد لاتکس مک‌فارلند باشد.
5. در طول زمان ذخیره‌سازی، قرار گرفتن در معرض نور استاندارد مک‌فارلند، می‌تواند بر اندازه‌گیری کدورت تأثیر بگذارد.

همچنین بخوانید:

• محیط کشت چیست؟ آشنایی با انواع محیط کشت و کاربرد
• تست حساسیت ضد میکروبی (AST): انواع و محدودیت‌ها
• میکروبیولوژی چیست؟ آشنایی کامل با علم میکروبیولوژی
• باکتری چیست؟ انواع، ساختار و کاربرد
• CFU چیست؟

منبع

مترجم: صادق حسینی‌کیا

چه نوع مشاغلی در بیوتکنولوژی وجود دارد؟

بیوتکنولوژی یک رشته چند رشته‌ای است که ترکیبی از علوم زیستی با فناوری‌های مدرن برای تولید محصولاتی است که به بهبود کشاورزی، محیط زیست، مراقبت های بهداشتی، محصولات غذایی، دارویی و غیره کمک می‌کند.

مشاغل بیوتکنولوژی

فارغ التحصیلان رشته بیوتکنولوژی می‌توانند فرصت‌های شغلی متنوعی را در بخش‌های خصوصی و دولتی با زیرشاخه های مختلف بیابند زیرا این برنامه به طور گسترده در انواع مختلف صنایع از جمله – کشاورزی، حفاظت از محیط زیست، مراقبت های بهداشتی، داروها و غیره استفاده می‌شود. بیوتکنولوژی با معرفی صنایع و بخش‌های بی‌شماری تقاضای زیادی در بازار کار امروزی دارد. در زیر تعدادی از آنها ذکر شده است.

• مراقبت‌های بهداشتی
• کارخانه‌های بازیافت
• دام پروری
• صنایع کشاورزی
• تصفیه‌خانه فاضلاب
• صنایع فراوری زیستی
• صنایع تبدیلی مواد غذایی
• اداره باغبانی
• تحقیقات بالینی
• تکنسین‌های پزشکی قانونی
• متخصصان تولید زیستی
• بیوشیمی دانان و بیوفیزیکدانان
• تکنسین گلخانه یا زمین
• بیوتکنولوژی و صنایع تحقیقاتی
• مهندسان ژنتیک و بیومدیکال
• جانورشناسان و زیست شناسان حیات وحش
• اپیدمیولوژیست‌ها و میکروبیولوژیست‌ها
• تحقیقات دارویی و صنایع شیمیایی
• تکنسین‌ها یا تکنسین‌های آزمایشگاه پزشکی و بالینی
• سیستم های مدیریت پسماند و کنترل محیط زیست
• آزمایشگاه‌های پزشکی قانونی و سایر آزمایشگاه‌های پزشکی

فرصت‌های شغلی برای دانشجویان دارای مدرک بیوتکنولوژی هم در ایران و هم در خارج از کشور فراوان است.

همچنین بخوانید:

• بیوتکنولوژی چیست؟
• مهندسی ژنتیک چیست؟
• میکروبیولوژی چیست؟ آشنایی کامل با علم میکروبیولوژی
• مدیریت پسماند بیمارستانی و آزمایشگاهی چگونه انجام می‌شود؟

منبع

 

مترجم: حنانه بریمانی

مدیریت پسماند بیمارستانی و آزمایشگاهی چگونه انجام می‌شود؟

​

 

​

 

مقدمه‌ای بر مدیریت پسماند بیمارستانی و آزمایشگاهی

مدیریت پسماند بیمارستانی و آزمایشگاهی در حال تبدیل شدن به یک مسئله مهم در اکثر کشورهای جهان است. این پسماندها به دلیل ماهیت عفونی و سمی خود، خطرات بهداشتی و ایمنی متعددی را به همراه دارند. فعالیت‌های مربوط به مراقبت‌های بهداشتی مانند تشخیص، درمان، و ایمن‌سازی انسان‌ها یا حیوانات یا در حین انجام تحقیقات باعث تولید پسماند بیمارستانی می‌شود. همچنین زباله‌های تولید شده از آزمایشگاه‌های صنعتی، مؤسسات آموزشی، بیمارستان‌ها و آزمایشگاه‌ها، پسماند آزمایشگاهی هستند.

1. Park بیانیه داد که: “اجازه دهید پسماند مربوط به “بیماران” زندگی “افراد سالم” را آلوده نکند و همچنین تصریح کرد که مدیریت صحیح پسماند بیمارستان‌ها و آزمایشگاه‌ها نقش مهمی در بهبود سلامت عمومی و همچنین کیفیت محیط زیست ایفا می‌کند. بنابراین باید با این گونه پسماندها با احتیاط بیشتری نسبت به پسماند شهری عمومی برخورد و رفتار شود.

منابع پسماندها

موارد زیر پسماند بیمارستانی و آزمایشگاهی تولید می‌کنند:

• بیمارستان‌های دولتی و خصوصی
• خانه‌های سالمندان و کلینیک‌ها
• آزمایشگاه‌های مؤسسات آموزشی و صنایع مختلف
• مراکز مراقبت‌های بهداشتی اولیه
• بانک خون و مراکز جمع آوری
• سردخانه‌ها
• مراکز تحقیقات و آموزش پزشکی و غیره

دسته‌بندی پسماندها

پسماند بیمارستانی و آزمایشگاهی را می‌توان به طور کلی به سه گروه طبقه‌بندی کرد:

• پسماند غیر خطرناک: که 80 درصد یا بیشتر از کل پسماندها را پوشش می‌دهند و شامل پسماند عمومی محل کار یا آشپزخانه می‌شود.
• پسماند عفونی: که 10 تا 15 درصد از کل پسماندها را پوشش می‌دهند و شامل اجسام نوک تیز و هر چیزی که به خون، مایعات بدن یا اعضای بدن آلوده است، می‌شوند.
• پسماند غیر عفونی اما خطرناک: که 5 درصد از کل پسماندها را پوشش می‌دهد و شامل ظاهر کننده فیلم اشعه ایکس، رنگ‌های شیمیایی، پسماند دارویی، سمی و هسته‌ای، باتری‌ها، روغن‌های مصرف شده، حلال‌های مصرف شده یا اقلام جیوه‌ای می‌باشند.

شهرداری یا مقامات دولتی پسماند غیر خطرناک را مدیریت می‌کنند، در حالی که بیمارستان‌ها و آزمایشگاه‌ها پسماند عفونی و خطرناک را مدیریت می‌کنند.

WHO پسماند بیمارستانی را در 9 نوع طبقه‌بندی کرده است که بر اساس آن پسماندها به دو دسته قابل بازیافت یا قابل سوزاندن تفکیک می‌شوند:

1. پسماند عمومی: خطری برای سلامتی انسان ندارد. به عنوان مثال: کاغذ مصرفی در ادارات، لفاف، پسماند خاکروبه عمومی و غیره.
2. پسماند پاتولوژیک (Pathologic): بافت یا مایع انسانی. به عنوان مثال: مایعات بدن، بافت بدن، اعضای بدن.
3. پسماند تیز: اقلام پسماندی تیز. به عنوان مثال: سوزن، چاقوی جراحی، چاقو و غیره.
4. پسماند عفونی: می‌توانند بیماری‌های باکتریایی، ویروسی یا انگلی را انتقال دهند. به عنوان مثال: پسماند آزمایشگاهی، پنبه یا گاز استفاده شده، سواب بافت، باند، تجهیزات بخیه و غیره.
5. پسماند شیمیایی: مواد شیمیایی مورد استفاده در درمان یا تشخیص، به عنوان مثال: شناساگرهای آزمایشگاهی، ضد عفونی کننده‌ها، ظاهر کننده فیلم اشعه ایکس و غیره
6. پسماند رادیواکتیوی: مایع استفاده نشده از رادیوتراپی یا تحقیقات آزمایشگاهی، ظروف شیشه‌ای آلوده و غیره.
7. پسماند دارویی: داروهای تاریخ مصرف گذشته یا قدیمی.
8. ظرف تحت فشار: سیلندر گاز، قوطی اسپری و غیره.
9. پسماند ژنوتوکسیک (Genotoxic): پسماند حاوی داروهای سیتوتوکسیک (Cytotoxic) مورد استفاده در درمان سرطان.

انواع و ماهیت پسماند بیمارستانی به خدمات موجود در بیمارستان و ماهیت بیمارستان بستگی دارد.

مدیریت پسماند بیمارستانی و آزمایشگاهی (نکات و مراحل)

یک سیستم مدیریت پسماند عبارت است از جمع‌آوری، دسته‌بندی، ذخیره‌سازی، حمل و نقل و دفع اصولی پسماند تولید شده، توسط یک سازمان. یک ایده مهم برای موفقیت سیستم، به حداقل رساندن پسماند می‌باشد. کارکنان بیمارستان‌ها و آزمایشگاه‌ها باید تشویق شوند تا پسماند کمتری تولید کنند.

چند نکته در مورد نحوه مدیریت پسماندها

• اجرای اصل 3R؛ کاهش (Reduce)، استفاده مجدد (Reuse) و بازیافت (Recycle).
• دستگاه‌ها را به روز نگه دارید.
• سعی کنید از خرید مواد شیمیایی به صورت عمده خودداری کنید.
• تا جایی که ممکن است مواد را بازیافت و دوباره استفاده کنید. عوامل شیمیایی مانند زایلن (Xylene)، فرمالین (Formalin) و الکل اتیلیک (Ethyl alcohol) را می‌توان تقطیر، فیلتر یا بازیافت کرد.
• در صورت عدم استفاده، اندازه و تعداد ظروف را کاهش دهید.
• تمام پسماند خطرناک را در ظروف نگه‌داری مناسب با برچسب گذاری مناسب نگه‌داری کنید.
• به طور منظم کارمندان را در مورد رویه‌های ایمنی آموزش دهید زیرا فقط توضیح شفاهی کافی نیست. آنان را در مورد اضافه کردن و حذف زباله از ظروف نگه‌داری و انواع پسماند خطرناک و عفونی آموزش دهید.

مراحل مدیریت پسماند

• تفکیک زباله

ماهیت پسماند بیمارستانی و آزمایشگاهی، نحوه مدیریت آن‌ها را تعیین می‌کند. بنابراین اولین گام مدیریت پسماند، تفکیک زباله است.

تفکیک زباله در نقطه تولید زباله اجرا می‌شود. انواع مختلف پسماندها در کیسه‌ها یا ظروف جداگانه با رنگ‌های کدبندی شده و دارای برچسب مناسب نگه‌داری می‌شوند. کدهای رنگ برای انواع مختلف پسماند در کشورها متفاوت است. با این حال، استفاده از سطل‌های قرمز، زرد، سفید، آبی و سیاه رنگ رایج می‌باشد. برچسب زدن روی هر سطل با نمادهایی مانند نشان خطر زیستی و سمیت سلولی (Cytotoxicity) ضروری است. نظافت و ضدعفونی کردن منظم سطل زباله بسیار مهم است.

ماهیت پسماند در سطل‌های مختلف در شکل نشان داده شده است:

​

توجه: از سطل‌های زباله غیر از رنگ های مشکی، قرمز، زرد، آبی و سفید رنگ جهت دفع پسماند عمومی استفاده کنید.

• ذخیره‌سازی و حمل و نقل پسماند

پسماندها نباید برای مدت طولانی در ناحیه تولید باقی بمانند و برای مدیریت و دفع باید در یک ظرف در بسته حمل شوند.

مدیریت پسماندها

• تصفیه شیمیایی

تصفیه شیمیایی برای همه انواع پسماندها به جز اعضای بدن و مایعات بدن اعمال می‌شود. کاربران باید هنگام کار با مواد شیمیایی از لباس‌های محافظ، دستکش و عینک استفاده کنند. مواد شیمیایی مورد استفاده در ضد عفونی می‌تواند با توجه به نوع پسماند متفاوت باشد. برخی از این مواد شیمیایی عبارتند از سفید کننده، هیپوکلریت سدیم (Sodium hypochlorite)، کلر و غیره.

• تابش مایکروویو

این روش برای همه پسماندها به جز فلزات بزرگ و اجزای بدن موثر است. فرکانس 2450 مگاهرتز با طول موج 12.24 سانتی‌متر اکثر میکروب‌ها را از بین می‌برد. آب پسماندها گرم می‌شود که این امر جزء عفونی را از بین می‌برد.

• اتوکلاو کردن (Autoclaving)

از آن برای استریل کردن پانسمان‌ها، دستکش‌ها، سرنگ‌ها، ابزارهای خاص، پلیت‌های (Plate) کشت دور انداخته شده و محیط‌های کشت استفاده می‌شود. پلاستیک‌ها و ابزارهای تیز نباید در اتوکلاو قرار گیرند. دمای 121 درجه سانتی‌گراد تحت فشار 15 پوند بر اینچ مربع برای استریل کردن به اندازه کافی مؤثر است.

• کپسوله‌سازی (Encapsulation)

این روش برای دفع ایمن اجسام تیز توصیه می‌شود. پسماندها در یک ظرف ضد سوراخ شدن جمع‌آوری می‌شوند. بعد از این‌که به اندازه سه چهارم پر شد، در آن موادی مانند سیمان، فوم پلاستیکی یا خاک رس ریخته شده و پس از خشک شدن، دور ریخته می‌شود.

• سوزاندن

سوزاندن فقط در مورد اکثر پسماند خطرناکی که قابل استفاده مجدد یا بازیافت نیستند یا در محل دفن پسماند قابل دفع نیستند، اعمال می‌شود. دمای بالا و فرآیند اکسیداسیون خشک مربوط به یک زباله‌سوز، پسماند آلی و قابل احتراق را در حجم و وزن کم به پسماند غیر آلی تبدیل می‌کند. در نهایت، خاکستر تولید شده و در محل دفن بهداشتی، دفع می‌شود.

پسماندی که قابل سوزاندن نیستند عبارتند از:

• ظروف تحت فشار
• پلاستیک‌های هالوژنه
• پسماندها با محتوای بالای فلزات سنگین
• پسماند رادیواکتیوی

انواع زباله‌سوز

1. زباله‌سوز تک محفظه

در این‌جا پسماندها در دمای 300 تا 400 درجه سانتی‌گراد سوزانده می‌شوند. این نوع زباله‌سوز ممکن است به دلیل دمای پایین به استریلیزاسیون مناسب نرسد.

1. زباله‌سوز دو محفظه‌ای

در این نوع زباله سوز، زباله در محفظه اولیه در دمای 800 درجه سانتی‌گراد سوزانده می‌شود، در حالی که گاز فرار در محفظه دوم در دمای 50 +/- 1000 درجه سانتی‌گراد سوزانده می‌شود.

1. زباله‌سوز پیرولیتیک (Pyrolytic)

ترکیب بی‌هوازی در زباله‌سوز پیرولیتیک دو محفظه‌ای در دمای 900 تا 1200 درجه سانتی‌گراد انجام می‌شود. پسماندها به مایع و گازهای قابل احتراق تبدیل می‌شوند که می‌توانند به عنوان سوخت برای پیرولیز (تجزیه در اثر حرارت (Pyrolysis)) استفاده شوند. این زباله‌سوز هزینه‌های عملیاتی را کاهش می‌دهد. در مقایسه با زباله‌سوزهای معمولی، زباله‌سوز پیرولیتیک دارای نرخ بازیافت انرژی بالا و آلودگی کمتر بوده و مقرون به صرفه است.

​

پیرولیز پسماندها با استفاده از کوره دوار

زباله‌سوز معایب خاصی مانند انتشار گازهای سمی، مواد سرطان‌زا و سمومی مانند دیوکسین‌ها (Dioxin)، فوران‌ها (Furan) و جیوه دارد. فیلترهای پارچه‌ای در دودکش‌های محفظه زباله‌سوز تعبیه شده‌اند تا انتشاری چنین موادی را به حداقل برسانند.

فناوری پلاسما (Plasma)

این فناوری یک تکنیک جدید است که از یک ابر گازی تولید شده به وسیله یونیزه کردن یک گاز بی‌اثر، استفاده می‌کند. در نتیجه دمای بالایی تا 3000 درجه سانتی‌گراد تولید می‌شود که عوامل بیماری‌زا را در پسماندها از بین می‌برد. سپس محصول نهایی در محل دفن زباله دفع می‌شود.

اگرچه استفاده از فناوری پلاسما گران است، اما دارای مزایای خاصی مانند موارد ذیل می‌باشد:

• هیچ محصول مضری آزاد نمی‌شود.
• حجم نهایی کاهش می‌یابد.
• انرژی گرمایی تولید شده را می‌توان برای کاهش هزینه عملیات بازیافت کرد.

با این حال، پسماند بیمارستانی و آزمایشگاهی اغلب سوزانده یا اتوکلاو می‌شوند.

دفع زباله

پس از ضدعفونی کردن مناسب پسماند، اکنون دفع آن بی خطر است.

دفن زباله

دفن زباله قدیمی‌ترین فناوری است، اما هنوز هم چندین کشور کم درآمد به آن متکی هستند. ایده اصلی این روش، تجزیه پسماند به مواد بی ضرر از طریق ذخیره‌سازی طولانی مدت است. متاسفانه در این روش مشکل نفوذ به وجود می‌آید. در نتیجه مواد سمی، بیماری‌زا یا رادیواکتیو به منابع آب و خاک نفوذ پیدا می‌کنند.

به دلیل خطرات بهداشت عمومی باید از دفن پسماند به صورت رو باز اجتناب شود.

محل دفن بهداشتی

محل دفن بهداشتی با یک سیستم ضد نشت برای غلبه بر اثرات مضر دفن پسماند عمومی ساخته شده است. این محل با خاک رس، پلی‌اتیلن (Polyethene) با چگالی بالا، یک سیستم جمع آوری گاز و خطوط لوله خروجی پوشیده شده است. اما قبل از دفن پسماند، ضدعفونی کردن و کاهش آن ضروری است.

​

محل دفن بهداشتی مدرن به عنوان جایگزین محل دفن رو باز

پسماند مایع با زهکشی فاضلاب دفع می‌شوند.

مدیریت صحیح پسماند به برنامه‌ریزی، بودجه و اجرای خوب و تعهد در سطح سیاستی بستگی دارد. اگر مدیریت پسماند به درستی اجرا شود هم به نفع افراد و هم محیط زیست خواهد بود. فن‌آوری‌های تبدیل ممکن است بر روی قطعات پلاستیکی یا لیگنوسلولز (Lignocellulose)، پنبه، کاغذ و غیره اعمال شوند تا آن‌ها را به سوخت یا موادی تبدیل کند که بتواند با زباله‌های شهری ترکیب شود.

عاقلانه است که بیمارستان‌ها و آزمایشگاه‌ها با شهرداری‌های محلی برای مدیریت پسماند همکاری کنند. به غیر از سازمان‌های دولتی و محلی، پسماندها می‌توانند توسط آژانس‌های بین‌المللی مختلف نیز اداره شوند.

همچنین بخوانید:

• اتوکلاو چیست؟
• زیست توده (BIOMASS) چیست؟
• اکولوژی یا بوم شناسی چیست؟ 7 سوال متداول اکولوژی

مترجم: صادق حسینی‌کیا

​

آسپرژیلوس نایجر چیست؟ مورفولوژی، زیستگاه و محیط کشت

آسپرژیلوس نایجر چیست؟

• آسپرژیلوس نایجر شایع‌ترین گونه آسپرژیلوس است.
• نام آن برگرفته از نام لاتین aspergillum است (به معنای آب‌پاش) چراکه در زیر میکروسکوپ ظاهری شبیه به آب‌پاش دارد.
• به طور معمول باعث ایجاد کپک سیاه در میوه‌ها و سبزیجاتی مانند انگور، زردآلو، پیاز و بادام زمینی می‌شود.
• باعث آلودگی و فساد مواد غذایی می‌شود.
• همچنین قادر به ایجاد عفونت‌های تنفسی فرصت‌طلب مرتبط با ذات‌الریه در افراد دارای نقص ایمنی نسبت به سایر گونه‌های آسپرژیلوس مانند آسپرژیلوس فلاووس، آسپرژیلوس فومیگاتوس و آسپرژیلوس کلاواتوس است.
• همه جا در خاک و گاهی اوقات در منازل یافت می‌شود، سیاه به نظر می‌رسد، از این رو به آن کپک سیاه نیز می‌گویند.
• آسپرژیلوس نایجر قرن‌هاست که در تولید اسید سیتریک استفاده می‌شود، که یک نگهدارنده معمول غذا در میوه‌های کنسرو شده، شامپوها و نگهدارنده خون است.
• برخی از سویه‌های آسپرژیلوس نایجر مایکوتوکسین تولید می‌کنند، از جمله اکراتوکسین A، بازدارنده‌ی ایزوفلاون اوروبول.

تاریخچه آسپرژیلوس نایجر

• آسپرژیلوس نایجر از نظر مورفولوژی، فیزیولوژی، فواید، شایع‌ترین و بیشترین گونه مورد مطالعه در آسپرژیلوس‌ها است.
• درنتیجه هم برای انسان و هم برای حیوانات کمتر ایجاد بیماری‌ می‌کند.
• در سال 1917، یک شیمیدان مواد غذایی به نام جیمز کوری کشف کرد که آسپرژیلوس نایجر هنگامی که در محیط حاوی قند کشت می‌شود، در غلظت‌های بالایی اسید سیتریک تولید می‌کند. او پس از استخراج اسید، روی فواید آن به عنوان نگهدارنده مواد غذایی مطالعه کرد.
• مطالعات دیگر همچنین نشان داد که می‌توان از آن در تولید گلوکومیلاز، α-گالاکتوزیداز و بسیاری دیگر از آنزیم‌های مهم صنعتی استفاده کرد.
• بر اساس این یافته‌ها و سایر مطالعات مربوط به تحقیقات مورفولوژیکی، دانشمندان به این نتیجه رسیدند که آسپرژیلوس نایجر سویه‌های متفاوتی با خواص متفاوت دارد.
• در سال 2004، چندین گونه شبیه به آسپرژیلوس نایجر توسط گروهی از محققینی که در حال مطالعه روی اکراتوکسین تولید شده توسط آسپرژیلوس نایجر بودند، کشف شد. این گونه‌ها شامل زیرجنس Circumdati، بخش Nigri که دارای 15 هاگ سیاه است که بسیار شبیه به اسپور Aspergillus niger است، می‌باشد. آن‌ها A. Tubingensis، A. Foetidus، A. Carbonarius و A. Awamori می‌باشند.

[caption id="attachment_34406" align="aligncenter" width="480"] آسپرژیلوس نایجر زیر میکروسکوپ[/caption]

زیستگاه آسپرژیلوس نایجر

• آسپرژیلوس نایجر در برابر حرارت بسیار مقاوم است. بنابراین می تواند در شرایط دمایی حاد مثل  دماهای بسیار پایین و بسیار بالا رشد کند.
• شکل غیرجنسی تولیدمثل آن که باعث می‌شود در هر نوع محیطی که شرایط مساعد است رشد کند. بنابراین موجودی فرصت‌طلب است.
•  در پوشش‌های گیاهی در حال پوسیدن مانند توده‌های کمپوست و برگ‌های مرده، در خاک زندگی می‌کند. همچنین می‌توان آن را در بسیاری از مکان‌ها از جمله در غلات و دانه‌های ذخیره شده، میوه‌های خشک، آجیل خشک و پلی‌استر یافت.
• مطالعه اخیر در ایستگاه‌های فضایی بین‌المللی نشان داد که Apsergillusniger به شدت با تشعشعات فضایی سازگار است؛ محیطی که به شدت تحت تاثیر اشعه UV، اشعه ایکس و شعله‌های خورشیدی است. این میزان سازگاری بالای آسپرژیلوس نایجر را نشان می‌دهد.

مورفولوژی آسپرژیلوس نایجر

آسپرژیلوس نایجر یک قارچ رشته‌ای است. هیف‌های رشته‌ای را تشکیل می‌دهد که آن‌ها را شبیه گیاهان کوچک می‌کند.

مشاهدات ماکروسکوپی آسپرژیلوس نایجر نشان می‌دهد که در ابتدای رشد سفید هستند، اما پس از چند روز به رنگ سیاه تبدیل می شوند و اسپور تولید می‌کنند.

نمای میکروسکوپی از آسپرژیلوس نایجر نشان می‌دهد که آسپرژیلوس نایجر دارای کندیوفورها و کنیدیوم‌های رنگی صاف است. کونیدیوفورها برآمدگی‌هایی از یک سپتات و هیف‌های هیالین هستند. سرهای کنیدیال به صورت شعاعی به نظر می‌رسند و به ستون‌هایی تقسیم می‌شوند. وزیکول کنیدیوفور سلول‌های استریلی به نام متولا تولید می‌کند که از فیالیدهای روی کندیوفورها محافظت می‌کنند.

کونیدیوفورها 400-3000 میلی‌متر طول دارند، صاف و هیالین هستند.

کنیدیوفور در قسمت راس تیره می‌شود و به وزیکول کروی با قطر 30-75 میلی‌متر ختم می‌شود.

متول‌ها و فیالیدها وزیکول را می‌پوشانند.

فیالیدها کندیایی تولید می‌کنند که بافت خشن، قهوه‌ای تیره و قطر 4-5 میلی‌متر دارند.

ویژگی‌های آسپرژیلوس نایجر روی محیط کشت

به طور کلی، آنها ظاهری پنبه ای دارند. ابتدا از رنگ سفید به زرد و سپس سیاه می‌شود. از کنیدیوفورهای نمدی تشکیل شده است. ریورس آن سفید تا زرد است. زیر میکروسکوپ، سرهای کندیوم با سلول‌های مخروطی مشاهده می‌شود. کنیدیا قهوه‌ای.

در مشاهدات ماکروسکوپی کلنی‌ها بر روی دکستروز آگار سیب زمینی در دمای 25 درجه سانتیگراد در ابتدا سفید هستند و به سرعت با تولید کنیدی‌ها، سیاه می‌شود. شکل ریورس آن زرد کم رنگ است و رشد آن می‌تواند باعث ایجاد شکاف‌های شعاعی در آگار شود.

آگار عصاره مالت – انکوبه ماندن به مدت 7 روز در دمای 25 و 37 درجه سانتی‌گراد که کلنی‌هایی با دیواره صاف کنیدیاها را ایجاد می‌کند.

[caption id="attachment_34404" align="aligncenter" width="503"] شکل: کلنی آسپرژیلوس نایجر روی مالت عصاره آگار (MEA). منبع تصویر: http://fungi.myspecies.info/file/943[/caption]

آگار مخمر Czapek – پس از 5 روز انکوباسیون در دمای 25 و 37 درجه سانتی‌گراد، کلنی‌های سیاه رنگ با دیواره صاف پشمی از کنیدی‌ها را تولید می‌کنند.

[caption id="attachment_34405" align="aligncenter" width="616"] شکل: کلنی آسپرژیلوس نایجر در آگار مخمر Czapek. منبع تصویر: http://fungi.myspecies.info/file/945[/caption]

چرخه زندگی

• آسپرژیلوس نایجر با تشکیل هاگ‌های کندیال به صورت غیرجنسی تولید مثل می‌کند.
• چرخه زندگی با پراکندگی کندی‌ها در شرایط مطلوب حداقل 25-40 درجه سانتی‌گراد شروع می‌شود.
• سپس کنیدی‌ها جوانه زده و یک سلول رویشی را تشکیل می‌دهند
• سلول‌ها به میسلیوم هیف تبدیل می‌شوند که به صورت دو شاخه می‌شوند و هیف‌های هوایی را تشکیل می‌دهند.
• سپس هیف‌های هوایی رشد می‌کنند و کونیدیوفورهایی را تشکیل می‌دهند که در راس متورم هستند و قسمت وزیکول کنیدیوفور را تشکیل می‌دهند.
• وزیکول‌ها، استریگمات اولیه به نام فیالیدها را تشکیل می‌دهند.
• استریگمات‌های ابتدایی، استریگمات‌های ثانویه را تشکیل می‌دهند که شروع به تولید هاگ‌های کندیالی می‌کنند.
• هاگ‌ها در چند ردیف روی فیالیدها قرار گرفته‌اند.

بیماری‌زایی آسپرژیلوس نایجر

تظاهرات موجود در گیاهان:

• آسپرژیلوس نایجر با آلوده کردن جوانه پیاز باعث ایجاد کپک سیاه پیاز و گیاهان زینتی می‌شود. می‌تواند منتشر شود و زمانی که شرایط مساعد باشد آشکار شود.

• آسپرژیلوس نایجر باعث یک بیماری رایج پس از برداشت پیاز می‌شود که در آن می‌توان کندی‌های سیاه را بین فلس‌های پیاز مشاهده کرد.
• همچنین می‌تواند باعث بیماری در بادام زمینی و انگور شود.

بیماری انسان و حیوان:

• بر خلاف سایر گونه‌های معمول آسپرژیلوس، احتمال کمتری دارد که در انسان و حیوانات ایجاد بیماری کند.
• با این حال، در موارد نادر، می‌تواند باعث آسپرژیلوز ریوی مهاجم و فرصت‌طلب در افراد مبتلا به نقص سیستم ایمنی شود. این موجب آسیب به اپیتلیال و سیستم تنفسی، و بیماری شدید ریوی شود.
• همچنین می‌تواند باعث آسپرژیلوزیس در باغبان‌هایی که اغلب در معرض استنشاق گرد و غبار ذغال سنگ نارس غنی از اسپورهای آسپرژیلوس هستند، شود.
• همچنین یکی از علل شایع اتومیکوزیس، نوعی عفونت قارچی گوش است که با اختلالات موقتی شنوایی، درد و موارد شدید همراه است‌. این می‌تواند به کانال گوش و پرده تمپان آسیب برساند.

تشخیص آزمایشگاهی آسپرژیلوس نایجر

• معاینه میکروسکوپی برای نشان دادن هاگ‌های کندیایی با لبه قهوه‌ای تیره، کنیدیوفور قهوه‌ای.
• با استفاده از آگار دکستروز سیب زمینی، آگار مخمر Czapek و آگار مخمر مالت.
• توالی‌یابی ژنومی قارچ‌ها را می‌توان برای شناسایی و تمایز از سایر قارچ‌ها انجام داد.
• کروماتوگرافی لایه نازک می‌تواند برای شناسایی و تعیین کمیت مایکوتوکسین اکراتوکسین استفاده شود.

درمان عفونت‌های ناشی از آسپرژیلوس نایجر

• استفاده از داروهای ضد‌قارچ برای درمان آسپرژیلوز مهاجم و فرصت‌طلب این ضدقارچ‌ها عبارتند از ایتراکونازول و آمفوتریسین B.
• برای اتومیکوز از ایتراکونازول و استروئیدهای ضدالتهابی برای تسکین درد مانند استامینوفن استفاده کنید.

کنترل و پیشگیری

• حذف اسپورها و جلوگیری از رشد آسپرژیلوس نایجر با استفاده از درمان شیمیایی و ضدقارچی:
• استفاده از اتانول 70 درصد یا ایزوپروپیل الکل به مدت حدود 10 دقیقه که در نفوذ به دیواره سلولی هاگ و هیف‌های آن موثر است و به طور موثر آن‌ها را از بین می‌برد.
• فنل‌ها اسپورهای آسپرژیلوس نایجر را در عرض 20 دقیقه از بین می‌برند. می‌توان از صابون اسکراب، دهان‌شویه‌ها و ضدعفونی‌کننده‌های سطوح استفاده کرد.
• سفیدکننده‌های حاوی هیپوکلریت از رشد هاگ‌ها جلوگیری می‌کنند.

برای پیشگیری از عفونت اتومیکوز:

• هنگام شنا یا موج سواری از وارد شدن آب به گوش خود اجتناب کنید.
• بعد از دوش گرفتن گوش‌های خود را خشک کنید.
• از گذاشتن سواب پنبه‌ای داخل گوش خودداری کنید.
• از خاراندن پوست بیرون و داخل گوش خودداری کنید.
• بعد از ریختن آب در گوش از قطره گوش اسید استیک استفاده کنید.

کاربردهای صنعتی آسپرژیلوس نایجر

• آسپرژیلوس نایجر به دلیل تولید اسید سیتریک بسیار معروف است. عمدتاً به‌عنوان نگهدارنده مواد غذایی برای میوه‌های کنسرو شده، آجیل خشک و میوه‌های خشک استفاده می‌شود.
• همچنین گلیکوزید هیدرولاز تولید می‌کند، آنزیمی که برای تبدیل زیست توده به سوخت زیستی تولید می‌کند. این از طریق تجزیه سلولز و همی‌سلولز از دیواره سلولی گیاه به ماده‌ای که می‌تواند به اتانول تبدیل شود، صورت می‌گیرد.
• این گونه همچنین می‌تواند برای تولید متابولیت‌های فعال زیستی و همچنین سایر محصولات دارویی استفاده شود.
• آسپرژیلوس نایجر را می‌توان برای تولید مقادیر زیادی فروکتوالیگوساکارید سازگار کرد. این به دلیل فعالیت ترانس فروکتوزیل کننده قابل مشاهده آنزیم‌ها در سطح آن، می‌باشد.
• آسپرژیلوس نایجر دارای قابلیت جذب زیستی قوی است و در آن‌جا از کلنی‌های آن برای افزایش توانایی جذب برخی رنگ‌ها مانند رنگ قرمز کنگو و آبی 9 و حذف ناخالصی‌های آن‌ها استفاده می‌شود.

همچنین بخوانید:

• آسپرژیلوس (Aspergillus) چیست؟
• آسپرژیلوزیس چیست؟
• سابورو دکستروز آگار (SDA): ترکیب، اساس، کاربرد، تهیه و مورفولوژی کلنی
• زاپکس آگار (محیط کشت CZA): ترکیب، اصول، آماده‌سازی، نتایج و کاربرد
• محیط کشت PDA (پوتیتو دکستروز آگار): اساس، کاربرد، ترکیبات

مترجم: شقایق مرتاضی

منبع