چگونه یک درخت فیلوژنتیک رسم کنیم؟

فهرست مطالب  نمایش 

درخت فیلوژنتیک چیست؟

درخت فیلوژنتیک (Phylogenetic tree) یک نمایش بصری از رابطه بین ارگانیسم‌های مختلف است که مسیر تکامل آن‌ها از یک جد مشترک تا نسل‌های مختلف را در طول زمان نشان می‌دهد.

• شباهت‌ها و واگرایی میان توالی‌های بیولوژیکی مرتبط که با هم‌ترازی توالی آشکار می‌شوند، اغلب باید در حوزه درختان فیلوژنتیکی بیان شده و تجسم یابند. بنابراین، فیلوژنتیک مولکولی (Molecular phylogenetics) یک جنبه اساسی در بیوانفورماتیک (Bioinformatics) است.
• فیلوژنتیک مولکولی شاخه‌ای از فیلوژنی (Phylogeny) است که به آنالیز تفاوت‌های مولکولی ژنتیکی و ارثی، عمدتاً در توالی‌های DNA، برای به دست آوردن اطلاعاتی در مورد روابط تکاملی یک ارگانیسم می‌پردازد.
• شباهت کارکردهای بیولوژیکی و مکانیسم‌های مولکولی در ارگانیسم‌های زنده قویاً نشان می‌دهد که این گونه‌ها از یک جد مشترک به وجود آمده‌اند. فیلوژنتیک مولکولی از ساختار و کارکرد مولکول‌ها و نحوه تغییر آن‌ها در طول زمان برای پی بردن به این روابط تکاملی، استفاده می‌کند.
• از این تجزیه و تحلیل‌ها، می‌توان فرآیندهایی را که به وسیله آن‌ها تنوع در میان گونه‌ها به دست آمده است، مشخص کرد. نتیجه آنالیز فیلوژنتیک مولکولی در یک درخت فیلوژنتیک بیان می‌شود.

آنالیز فیلوژنتیک و نقش بیوانفورماتیک

داده‌های مولکولی که به شکل توالی‌های DNA یا پروتئین هستند نیز می‌توانند دیدگاه‌های تکاملی بسیار مفیدی را در مورد ارگانیسم‌های موجود ارائه دهند، زیرا با تکامل ارگانیسم‌ها، مواد ژنتیکی جهش‌هایی را در طول زمان اضافه می‌کنند و باعث ایجاد تغییرات فنوتیپی (Phenotypic) می‌شوند.

از آن‌جایی که ژن‌ها محیطی برای ثبت جهش‌های اضافه شده هستند، می‌توانند به عنوان فسیل‌های مولکولی (Molecular fossil) عمل کنند. از طریق آنالیز مقایسه‌ای (Comparative analysis) فسیل‌های مولکولی تعدادی از ارگانیسم‌های مرتبط، تاریخچه تکاملی ژن‌ها و حتی ارگانیسم‌ها را می‌توان آشکار کرد.

با این حال، استنتاج فیلوژنی به طور آشکار تلاش‌های بسیار دشواری است، زیرا تعداد جواب‌ها با تعداد گونه‌ها و تعداد عظیمی از سؤالات جدید در زیست‌شناسی تکاملی که می‌توانند از طریق استفاده از نمونه‌های تاکسونی (Taxon) بزرگ‌تر بررسی شوند، به شدت افزایش می‌یابد.

اما با توسعه و استفاده از محاسبات و مجموعه‌ای از ابزارهای بیوانفورماتیک، توانایی آنالیز مجموعه داده‌های بزرگ در زمان‌های محاسباتی عملی و ارائه جواب‌های بهینه یا نزدیک به بهینه با احتمال بالا، امکان پذیر شده است. در پاسخ به این روند، بسیاری از تحقیقات فعلی در حوزه فیلوانفورماتیک (Phyloinformatics) (به عنوان مثال، فیلوژنتیک محاسباتی (Computational phylogenetics)) بر توسعه رویکردهای ابتکاری (Heuristic) کارآمدتر متمرکز است.

مراحل آنالیز فیلوژنتیک

مراحل اساسی در هر آنالیز فیلوژنتیکی عبارتند از:

1. یک مجموعه داده را جمع‌آوری و هم‌تراز کنید.

• اولین مرحله شامل شناسایی یک پروتئین یا توالی DNA هدف و جمع‌آوری مجموعه داده‌ای متشکل از سایر توالی‌های مرتبط است.
• توالی‌های DNA هدف را می‌توان با استفاده از NCBI BLAST یا ابزارهای جستجوی مشابه، بازیابی کرد.
• هنگامی که توالی‌ها انتخاب و بازیابی شدند، هم‌ترازسازی چند توالی (Multiple Sequence Alignment) ایجاد می‌شود.
• این امر شامل مرتب کردن مجموعه‌ای از توالی‌ها در یک ماتریس برای شناسایی مناطق همسانی است.
• وب‌سایت‌ها و برنامه‌های نرم‌افزاری زیادی مانند ClustalW، MSA، MAFFT و T-Coffee وجود دارند که برای انجام هم‌ترازسازی چند توالی بر روی یک مجموعه از داده‌های مولکولی طراحی شده‌اند.

2. ساخت (تخمین) درختان فیلوژنتیک از توالی‌ها با استفاده از روش‌های محاسباتی و مدل‌های تصادفی

• برای ساخت درختان فیلوژنتیک، از روش‌های آماری برای تعیین توپولوژی (Topology) درخت و محاسبه طول شاخه‌ها استفاده می‌شود که روابط فیلوژنتیکی توالی‌های هم‌تراز شده در یک مجموعه داده را به بهترین شکل توصیف می‌کند.
• رایج‌ترین روش‌های محاسباتی مورد استفاده شامل روش‌های ماتریس فاصله، و روش‌های داده‌های گسسته، مانند بیشترین بهینگی (Maximum parsimony) و حداکثر درست‌نمایی (Maximum likelihood) است.
• پکیج‌های نرم‌افزاری متعددی مانند Paup، PAML، PHYLIP وجود دارند که از این روش‌های بسیار محبوب استفاده می‌کنند.

3. درختان تخمین زده شده را به صورت آماری آزمایش و ارزیابی کنید.

• الگوریتم‌های تخمین درخت یک یا چند درخت بهینه تولید می‌کنند.
• این مجموعه از درختان ممکن، تحت یک سری آزمایش‌های آماری قرار می‌گیرند تا ارزیابی شوند که آیا یک درخت بهتر از دیگری می‌باشد یا نه و آیا فیلوژنی پیشنهادی منطقی است.
• روش‌های متداول برای ارزیابی درختان شامل روش‌های نمونه‌برداری مجدد Bootstrap و Jackknife و روش‌های تحلیلی مانند حداکثر بهینگی، فاصله و درست‌نمایی است.

ابزارهای بیوانفورماتیک برای آنالیز فیلوژنتیک

• چندین ابزار بیوانفورماتیک و پایگاه داده وجود دارد که می‌توان از آن‌ها برای آنالیز فیلوژنتیک استفاده کرد.
• این ابزارها عبارتند از PANTHER، P-Pod، PFam، TreeFam، و دایره‌المعارف فیلوژنومیک ساختاری PhyloFacts.
• هر یک از این پایگاه‌های اطلاعاتی از الگوریتم‌های متفاوتی استفاده می‌کنند و از منابع مختلفی در مورد اطلاعات توالی استفاده می‌کنند، و بنابراین درخت‌های تخمین زده‌شده توسط PANTHER، برای مثال ممکن است به طور قابل‌توجهی با درخت‌های تولید شده توسط P-Pod یا PFam متفاوت باشند.
• مانند تمام ابزارهای بیوانفورماتیک از این نوع، آزمایش روش‌های مختلف، مقایسه نتایج، سپس تعیین این‌که کدام پایگاه داده (بر اساس نتایج اجماع) برای مطالعات شامل انواع مختلف مجموعه داده‌ها، بهتر کار می‌کند، مهم است.

همچنین بخوانید:

• دوره مهارت آموزی بیوانفورماتیک

منبع

مترجم: صادق حسینی‌کیا

تجهیزات پزشکی آزمایشگاه تشخیص مولکولی

فهرست مطالب  نمایش 

تشخیص مولکولی چیست؟

آزمایشهای آزمایشگاه تشخیص مولکولی شامل استفاده از تکنیک‌های مختلف برای تشخیص و/یا تعیین کمیت نشانگرهای بیولوژیکی خاص در پروتئوم و ژنوم انسانی، ویروسی و میکروبی است. بیماری‌ها با مطالعه DNA، RNA و پروتئین‌های موجود در مایع یا بافت، برای دنباله‌های DNA یا RNA که کدگذاری می‌کنند، شناسایی می‌شوند.

 انواع مختلف تجهیزات پزشکی آزمایشگاه تشخیص مولکولی چیست؟

آزمایشات مولکولی برای سرطان، فارماکوژنومیک (ارزیابی داروهایی که برای فرد مناسب‌تر هستند – پزشکی شخصی)، آزمایش ژنتیک، بیماری‌های عفونی، پیش از تولد، بیماری‌های عصبی، بیماری‌های قلبی عروقی و حتی آنالیز پزشکی قانونی و غیره انجام می‌شود. تشخیص پاتوژن مانند شناسایی ویروس خاص عفونت‌ها، از جمله عوامل بیماری‌زای تنفسی، ادراری، واژن، مقاربتی، دستگاه گوارش یا سایر عوامل بیماری‌زا بخشی از کار برای شناسایی بیماری‌های عفونی است.

یک نمونه خون ساده برای به دست آوردن اطلاعات ژنتیکی از تومورها، پیوندها یا جنین متولد نشده کافی است. این به این دلیل است که اسیدهای نوکلئیک مورد نیاز برای روش‌های تشخیص مولکولی که قادر به شناسایی نشانگرهای زیستی حساس از نمونه‌های کوچک هستند، در پلاسمای انسان موجود هستند. در نتیجه، این تست‌ها نسبت به نمونه‌برداری سنتی بهتر هستند و همچنین قادر به تشخیص زودهنگام هستند.

آزمایشگاه‌های تشخیص مولکولی تأثیر زیادی در درمان بیماران دارند، زیرا بیماری‌های عفونی و سایر بیماری‌ها زودتر و با دقت بهتری شناسایی و درمان می‌شوند. برخی از آزمایشات تحت تشخیص مولکولی با شیمی بالینی (بررسی مایعات بدن) و سنجش‌های بیولوژیکی آزمایشگاهی مانند PCR-ELISA یا هیبریداسیون فلورسانس و غیره همپوشانی دارند.

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) محبوب ترین روش در تشخیص مولکولی بر اساس تشخیص اسید نوکلئیک است. PCR برای افزایش تعداد مولکول های اسید نوکلئیک استفاده می شود و در نتیجه توالی(های) هدف در نمونه تکثیر میشود.

دستگاه ترمال سایکلر اصلی ترین ابزار مورد نیاز برای انجام تکنیک PCR است.

در حالی که PCR در حال حاضر پرکاربردترین روش برای تشخیص توالی‌های DNA است، تکنیک‌های دیگری مانند Real Time PCR (qPCR)، توالی‌یابی مستقیم، تست میکرواری، dPCR و غیره نیز در حال گسترش هستند. تراشه های میکرواری تراشه های پیش ساخته ای هستند که نشانگرهای زیادی را همزمان آزمایش میکنند. آرایه های پروتئینی با کارایی بالا می توانند از DNA یا آنتی بادی های مکمل برای اتصال استفاده کنند و از این رو می توانند پروتئینهای مختلف را همزمان شناسایی کنند.

رشد بازار تجهیزات آزمایشگاهی تشخیص مولکولی

دامنه آزمایش RT-PCR در سال‌های اخیر به دلیل COVID-19 چندین برابر شده است. با این حال، حتی در آینده‌ای بدون آزمایش کووید، انتظار می‌رود RT-PCR / qPCR (همچنین PCR کمی نامیده می‌شود) یا dPCR (PCR دیجیتال) در مقابل PCR سنتی به دلیل بروز اختلالات ژنتیکی، شیوع بیماری‌های عفونی و رو به رشد پیشرفت کند. استفاده از نشانگرهای زیستی برای تشخیص بیماری‌ها مانند سرطان، CVD و غیره. مزیت روش‌های تشخیص مولکولی نسبت به روش‌های دیگر، مثلاً بیوپسی، این است که کمتر تهاجمی است و فرصتی را برای تشخیص و درمان زودهنگام بیماری زمینه‌ای فراهم می‌کند.

چه تجهیزاتی در آزمایشگاه تشخیص مولکولی مورد نیاز است؟

محصولات اصلی مورد استفاده در آزمایشگاه تشخیص مولکولی شامل تجهیزات/ابزار، معرف‌ها و مواد مصرفی هستند. معرف برای ایجاد یک واکنش شیمیایی استفاده می شود.

مواد مصرفی مورد استفاده عبارتند از:

• پیپت
• میکروپیپت
• اسلاید و غیره

انواع مختلفی از تجهیزات، معرف‌ها و مواد مصرفی بر اساس فناوری مورد استفاده برای آزمایش استفاده می‌شوند – توالی‌یابی DNA، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، فناوری تکثیر اسید نوکلئیک همدما، تکثیر با واسطه رونویسی، هیبریداسیون درجا، ریزآرایه‌ها، طیف‌سنجی جرمی، غیره بلات)، الکتروفورز ژل یا مویرگی، آنالیز STR، ترانس کریپتاز معکوس، توالی یابی مستقیم، جداسازی و کمی سازی اسید نوکلئیک و غیره.

با این حال، تمام تجهیزات مورد استفاده در آزمایشگاه تشخیص مولکولی در چهار دسته کلی زیر قرار میگیرند:

1. جداسازی، استخراج، خالص سازی و پردازش نوکلئیک اسید (DNA/RNA) مانند رونویسی معکوس
2. تکثیر (Amplification)
3. تجزیه و تحلیل
4. تجهیزات عمومی

تجهیزات آزمایشگاهی تشخیص مولکولی

بسته به دامنه کار، تجهیزات مورد نیاز برای آزمایشگاه تشخیص مولکولی معمولاً شامل موارد زیر است:

1. یخچال
2. فریزر
3. ورتکس میکسر
4. سانتریفیوژ
5. ترمال سایکلر
6. اسپکتروفتومتر
7. DNA Sequencer
8. میکروسکوپ
9. سیستم الکتروفورز
10. اتوکلاو
11. دستگاه انکوباتور
12. PH متر
13. میکروتوم
14. حمام آب
15. ژل داک
16. میکروسانتریفیوژها
17. شیکر
18. کابینت ایمنی زیستی
19. هود لامینار
20. سیستمهای بلاتینگ
21. آنالایزر هماتولوژی
22. آنالایزر شیمی بالینی و غیره

یخچال

از یخچالها برای نگهداری مواد شیمیایی آزمایشگاهی، معرفها، کیتها و سایر محصولات در دمای متوسط ۴ درجه سانتیگراد به علاوه استفاده می شود.

فریزر

از فریزرها برای نگهداری نمونه‌های بیمار و کشت بافتی که منجمد شده‌اند استفاده میشود. به جای استفاده از دو تجهیزات مختلف، میتوان از واحد ترکیبی یخچال و فریزر نیز استفاده کرد. محدوده دمایی مورد نیاز معمولاً از منفی۲۰ درجه سانتیگراد تا منفی ۸۰ درجه سانتیگراد است.

ورتکس میکسر یا مینی فیوژ

برای مخلوط کردن سریع اجزای مایع در لوله‌ها مانند مخلوط کردن ویالهای کوچک یا تعلیق مجدد سلولها استفاده میشود. این دستگاه از یک موتور الکتریکی با یک محور محرک عمودی متصل به یک فنجان لاستیکی که کمی خارج از مرکز نصب شده است، تشکیل شده است.

ممکن است چندین چاه داشته باشد که هر کدام لوله‌های آزمایش را نگه می‌دارند و غیره. موتور فنجان لاستیکی را در یک حرکت دایره‌ای با سرعت‌های ۱۰۰ تا ۳۶۰۰ دور در دقیقه به حرکت در می‌آورد تا یک گرداب یا یک جریان مارپیچی در نمونه ایجاد کند و اختلاط سریع مایعات را امکان‌پذیر کند.

سانتریفیوژ

از سانتریفیوژهای یخچالی و غیر یخچالی برای جداسازی قطعات بر اساس چگالی استفاده میشود. میکروسانتریفیوژها همچنین برای مقادیر کوچک نمونه که با سرعت بالا میچرخند استفاده میشود.

ترمال سایکلر

ترمال سایکلرها تجهیزات کلیدی برای تکثیر بخشهای اسیدنوکلئیک از طریق واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) هستند. PCR روشی است که در آن DNA الگو با استفاده از پرایمرهای مصنوعی – یک DNA پلیمراز و dNTPs تکثیر میشود. مخلوطی از نمونه اسید نوکلئیک و پرایمر‌ها بین حداقل 2 دما سایکل میشود: دمای بالا برای دناتوره کردن DNA دو رشته‌ای به مولکولهای تک رشته‌ای و دمای پایین برای هیبرید شدن پرایمر با الگو و برای پلیمراز برای گسترش پرایمر.

هر چرخه دما از نظر تئوری مقدار توالی هدف را دو برابر میکند. تشخیص توالی DNA امپلیفای شده را می توان با استفاده از ترمال سایکلرها تخصصی که قادر به تشخیص فلورسانس هستند، انجام داد.

اسپکتروفتومتر/ اسپکتروسکوپ

اسپکتروفتومتر یک ابزار تحلیلی است که برای اندازه‌گیری کمی نور مرئی، اشعه ماوراء بنفش، یا انتشار یا بازتاب نور مادون قرمز به عنوان تابعی از طول موج استفاده می‌شود. یک پرتو نور از نمونه ماده مورد مطالعه عبور داده میشود. اجزای مختلف نمونه دارای خواص متفاوتی در جذب نور هستند و از این رو نور را به طور متفاوتی منعکس یا عبور میدهند.

اسپکتروفتومترها شدت را به عنوان تابعی از طول موج منبع نور اندازه گیری میکنند. در آزمایشگاه تشخیص مولکولی، از اسپکتروفتومترها برای تعیین کمیت اسید نوکلئیک در نمونه استفاده میشود.

DNA Sequencer

توالی یابی DNA برای دانستن توالی چهار حرفی هر ژن یا بخشی از DNA، یعنی توالی آدنین (A)، تیمین (T)، سیتوزین (C) و گوانین (G) استفاده می شود. این برای شناسایی هر گونه ماده ژنتیکی انسانی، ویروسی و میکروبی یا گیاهی ضروری است.

میکروسکوپ

میکروسکوپها، به ویژه با دوربین برای مشاهده، ارزیابی نمونه‌ها و ذخیره نتایج استفاده میشوند.

سیستم الکتروفورز

بیشتر مولکول‌های زیستی به‌عنوان ذرات باردار الکتریکی در محلولی با pH معین، یون‌های دارای بار مثبت یا منفی، وجود دارند. هنگامی که جریان الکتریکی از یک ژل یا ماتریس دیگر عبور میکند، حرکت مولکولی نسبت به سیال تحت تأثیر یک میدان الکتریکی یکنواخت فضایی قابل مشاهده است.

SDS PAGE نوعی تکنیک الکتروفورز است که از آن برای جداسازی پروتئین ها استفاده می‌شود.

از این رو فرآیند الکتروفورز برای جداسازی DNA، RNA (اسید نوکلئیک) یا مولکولهای پروتئین بر اساس اندازه و بار الکتریکی، توالی DNA، تشخیص جهش و غیره استفاده میشود.

اتوکلاو

 

اتوکلاو در آزمایشگاهها برای استریل کردن تجهیزات و ابزار آزمایشگاهی استفاده میشود.

انکوباتور

انکوباتورها برای حفظ شرایط بهینه مانند دما و رطوبت در هنگام رشد و نگهداری کشتها استفاده میشوند.

PH متر

PH متر برای اندازه گیری اسیدیته یا قلیاییت در محلولهای مبتنی بر آب استفاده میشود.

میکروتوم

میکروتومها برای برش دادن نمونه‌های بافت استفاده میشوند. آنها ابزارهای برشی هستند که برشهای نازکی یا بخشهایی از بافت را تولید میکنند که میتوان آنها را زیر میکروسکوپ یا سایر سیستمهای تصویربرداری سلولی مشاهده کرد و تجزیه و تحلیل کرد.

حمام آب یا بن ماری

حمام آب وسیله‌ای است که در آزمایشگاه‌ها برای انکوبه کردن نمونه‌ها در آب نگهداری شده در دمای یکنواخت، کنترل‌شده و ثابت استفاده می‌شود.

ژل داک

ژل داک‌ها برای ثبت و اندازه گیری اسیدنوکلئیک، پروتئینها یا آنتی بادی‌های برچسب دار در انواع مختلف محیط‌ها مانند آگارز، اکریل آمید یا سلولز استفاده میشود. نمونه‌هایی که روی ژل‌های آگارز یا ظروف پتری قرار می‌گیرند، روی سطح نوردهی UV (فرابنفش) قرار می‌گیرند و از طریق یک دوربین CCD یا CMOS عکس‌برداری می‌شوند.

کابینت‌های ایمنی زیستی و هود لامینار 

کابینت ایمنی زیستی یک کابینت بیولوژیکی ایمن است که اساساً یک فضای کاری آزمایشگاهی محصور و دارای تهویه برای کار ایمن با موادی است که بالقوه آلوده به عوامل بیماری زا هستند. هود لامینار برای انتقال آسپتیک کشت میکروبی استفاده میشود.

سیستم‌های بلاتینگ

الکتروفورز اسید نوکلئیک از یک ماتریس ژل برای جداسازی قطعات DNA و RNA بر اساس اندازه و وزن مولکولی استفاده میکند. قطعات DNA و RNA که توسط الکتروفورز جدا شده‌اند، به صورت بلات به ماتریکس غشایی منتقل میشوند. پروب‌ها برای تشخیص وجود توالی‌های هدف بر روی ماتریس غشا استفاده میشوند. توالی‌های خاص DNA و RNA در یک نمونه به ترتیب با ساترن بلات و نورثرن بلات شناسایی میشوند.

همچنین بخوانید:

• دوره مهارت آموزی ژنتیک مولکولی
• آشنایی با انواع دستگاه های آزمایشگاهی
• Real-time PCR در تشخیص بیماری
• روش های الکتروفورز محصول PCR (آگارز و آکریل آمید)
• آموزش استخراج اسیدهای نوکلئیک ( DNA و RNA)

مترجم : معصومه قریبی ششده

منبع

رنگ آمیزی کالکوفلور سفید: اصول، روش، نتایج و کاربردها

رنگ آمیزی کالکوفلور سفید (Calcofluor White Staining) چیست؟

• کالکوفلور سفید یک رنگ آبی فلورسنت شیمیایی است که به طور غیر اختصاصی برای اتصال به پلیمرهای پلی‌ساکارید (Polysaccharide) مرتبط با بتای کیست‌های آمیب (Amoebic cyst) استفاده می‌شود.
• قابلیت آن، توانایی اتصال به پلی‌ساکاریدهای بتا 3-1 و بتا 4-1 در کیتین (Chitin) و سلولز (Cellulose) است که در دیواره سلولی قارچ‌ها، گیاهان و جلبک‌ها وجود دارد.
• این روش به دلیل سرعت در بررسی سلول‌ها، جایگزین روش رنگ آمیزی با هیدروکسید پتاسیم (Potassium Hydroxide (KOH)) شد.

اهداف رنگ آمیزی کالکوفلور سفید

• برای رنگ آمیزی عوامل قارچی و انگلی
• برای مشاهده وجود عوامل قارچی و انگلی در زیر میکروسکوپ فلورسنت

اصل رنگ آمیزی کالکوفلور سفید

• از روش رنگ آمیزی کالکوفلور سفید به‌عنوان یک رنگ تطبیقی به ویژه برای شناسایی عفونت قارچی اونیکومایکوز (Onychomycosis) استفاده می‌شود.
• ساختارهای حاوی کیتین زیر نور فرابنفش در میکروسکوپ فلورسنت به رنگ سفید درخشان، فلورسان می‌شوند.
• رنگ کالکوفلور سفید به عنوان یک فلوروکروم (Fluorochrome) غیر اختصاصی که به دیواره کیتین و سلولوز متصل می‌شود، به عنوان سریع‌ترین روش شناسایی قارچ‌ها و مخمرهای بیماری‌زا مانند پنوموسیستیس کارینی (Pneumocystis carinii)، میکروسپوریدیوم (Microsporidium)، آکانتامبا (Acanthamoeba)، ناگلریا (Naegleria) و گونه‌های بالاموتیا (Balamuthia)، شناخته شده است.
• رنگ کالکوفلور سفید هنگامی که با هیدروکسید پتاسیم مخلوط می‌شود، به خوبی عوامل قارچی را نمایان می‌کند.
• ضد رنگ (Counterstain) مورد استفاده در این روش، رنگ Evans است که پس‌زمینه تیره‌ای را تشکیل می‌دهد و بافت‌ها و سلول‌ها را قادر می‌سازد با استفاده از القا با نور آبی و نه اشعه ماوراء بنفش، فلورسانس کنند.
• عوامل دیگر، رنگ قرمز مایل به نارنجی فلورسانس می‌کنند در حالی که عوامل قارچی و انگلی به رنگ سبز مایل به زرد درخشان فلورسانس می‌نمایند.

شناساگرها

• رنگ کالکوفلور سفید
• هیدروکسید پتاسیم

روش رنگ آمیزی کالکوفلور سفید

1. نمونه را با دقت روی یک لام شیشه‌ای تمیز قرار دهید.
2. برای ایجاد یک فلورسانس شدید، یک قطره از رنگ آمیزی کالکوفلور سفید را اضافه کنید.
3. یک قطره هیدروکسید پتاسیم 10% اضافه کنید.
4. نمونه را با یک لامل بپوشانید و بگذارید برای 1 دقیقه بماند تا رنگ را جذب کند.
5. رنگ اضافی را با یک حوله کاغذی خشک با فشار ملایم روی لکه پاک کنید.
6. رنگ را زیر پرتوهای فرابنفش با بزرگنمایی 100 تا 400 برابر مشاهده کنید.

نتایج

قارچ‌ها، کیست‌های پنوموسیستیس، و انگل‌ها در زیر میکروسکوپ فلورسنت فرابنفش، به رنگ سبز مایل به زرد درخشان به نظر می‌رسند.

[caption id="attachment_30893" align="aligncenter" width="800"] a: رنگ آمیزی فلورسنت مخمر با کالکوفلور سفید؛ یک رنگ آبی روشن بر روی دیواره‌های سلولی مخمر نشان می‌دهد. b: سرخس عقابی (Eagle Fern) فلورسانس سبز روشن و آبی روشن را در رنگ آمیزی کالکوفلور سفید نشان می‌دهد[/caption]

تفسیر

محلول‌های آب‌دار کالکوفلور سفید، فلورسانس را در محدوده طول موج 300 تا 412 نانومتر (با حداکثر جذب در 347 نانومتر) جذب می‌کنند. حداکثر القا و فلورسانس با نور فرابنفش اتفاق می‌افتد، اگرچه القا با نور بنفش یا آبی-بنفش نیز نتایج خوبی به همراه دارد. بافت‌ها فلورسانس پس‌زمینه زرد مایل به سبز را نشان می‌دهند که در قارچ‌ها و انگل‌ها شدیدتر و قابل مشاهده‌تر هستند.

کاربردهای رنگ آمیزی کالکوفلور سفید

1. رنگ آمیزی کالکوفلور سفید را می‌توان در قارچ‌شناسی و انگل‌شناسی بالینی جهت:

• نشان دادن حضور انگل‌های آمیب با شناسایی کیست‌های آن‌ها.
• رنگ آمیزی اسکار جوانه‌های سلول‌های مخمر با محتوای بیشتر کیتین که امکان تعیین کمیت اسکار جوانه‌ها (که نشان‌دهنده سن سلول است) را فراهم می‌کند.

استفاده کرد.

2. رنگ آمیزی کالکوفلور سفید همچنین برای تقویت پاسخ مخمرها در پاپ اسمیر با رنگ پاپانیکولائو (Papanicolaou) استفاده می‌شود.
3. این روش برای رنگ آمیزی پنوموسیستیس (Pneumocystis)، میکروسپوریدیا (Microsporidia)، کریپتوسپوریدیوم (Cryptosporidium) و برخی کیست‌های انگلی که کالکوفلور مثبت هستند، استفاده می‌شود.
4. جهت تشخیص قارچ کاندیدا (Candida) در ضایعات سرطانی و پیش سرطانی در زیر میکروسکوپ فلورسنت، از رنگ آمیزی کالکوفلور سفید استفاده می‌شود.
5. کالکوفلور همچنین به عنوان رنگ در لباس‌های سفید استفاده می‌شود و یک ظاهر مشکی ایجاد می‌کند.
6. کالکوفلور یک رنگ روشن کننده پارچه است که قابل حل در آب و بی‌رنگ می‌باشد. از این رو به عنوان سفیدکننده پارچه به مواد شوینده اضافه می‌شود.

مزایا

• این روش یک راه سریع و آسان برای تشخیص در سیتوپاتولوژی (Cytopathology) و هیستوپاتولوژی (Histopathology) است
• برای رنگ آمیزی موثر به شناساگر خاصی نیاز ندارد.

محدودیت‌ها

• رنگ آمیزی کالکوفلور سفید گران است.
• این روش ممکن است در برخی موارد دقیق نباشد.

مطالب مرتبط:

• رنگ گیمسا (Giemsa): اصول، پروسه آماده‌سازی و استفاده، نتایج و تفسیر
• رنگ رایت
• رنگ Luxol fast blue stain چیست؟
• رنگ سافرانین
• رنگ های رومانوفسکی: اصول، انواع، کاربردها
• رنگ‌ آمیزی سلول‌ ها با رنگ‌ های هوچست Hoechst و DAPI

منبع

مترجم: صادق حسینی‌کیا

استخراج سلول های بنیادی از بافت

مقدمه‌ای بر استخراج سلول های بنیادی

سلول های بنیادی در نقاط مختلف بدن قرار گرفته‌اند. در افراد بالغ این سلول ها در مغز استخوان، بافت چربی، مغز، ریشه دندان، خون، کبد، قلب، ماهیچه های اسکلتی و … جای گرفته‌اند. بهترین تکنیک روشی است که طی آن با کمترین آسیب بتوان بیشترین مقدار سلول بنیادی را استخراج کرد.

یکی از مهم ترین شاخصه ها در روش انتخاب روش استخراج و بافت هدف، هدف استفاده از سلول های بنیادی می باشد. به عنوان مثال در پیوند مستقیم سلول بنیادی از یک فرد زنده به فرد دیگر، ناچاراً باید از سلول های بنیادی مغز استخوان بهره گرفت.

اگرچه این روش درد زیادی را متحمل فرد اهدا کننده خواهد کرد اما پس از انجام تست های تأییدی HLA typing، روشی جز استخراج مغز استخوان باقی نمی ماند. اما در مدل های تحقیقاتی می توان از بافت های دور ریز چربی انسانی که در عمل های زیبایی لیپوساکشن تولید می شود، استفاده کرد.

بافت های دور ریز چربی انسانی در عمل های زیبایی لیپوساکشن

سلول های بنیادی که به شکل گسترده توسط پژوهشگران استخراج و کشت می شوند شامل سلول های بنیادی جنینی (Embryonic Stem Cells) که از نوع سلول های Pluripotent هستند، سلول های بنیادی پرتوان القایی (induced Pluripotent Stem Cells) و سلول های بنیادی بالغ که از نوع سلول های Multipotent می باشند. طبیعتاً سلول های بنیادی متنوع و گسترده دیگری نیز در بدن انسان وجود دارند و از ارزش تحقیقاتی بالایی برخوردار هستند. اما این 3 نوع سلول جزء سلول های بسیار پرکاربرد و با روش های ساده‌تر در استخراج هستند.

مطالب مرتبط:

• انواع سلول های بنیادی و خاستگاه آن‌ها

سلول های بنیادی جنین جزء اولیه ترین سلول هایی بودند که در واپسین سال های قرن ۲۰ در دنیا استخراج و کشت شدند. در ایران نیز افرادی چون جناب آقای دکتر احمدرضا بهرامی و سرکار خانم دکتر مریم مقدم متین جزء اولین نفراتی بودند که این سلول ها را در همان سال های اولیه قرن ۲۱ استخراج کرده و کشت دادند.

سلول های بنیادی جنینی با اینکه توانایی تمایز به انواع سلول ها را با توان بسیار بالایی دارند اما از طرف دیگر استخراج و کشت آن ها سخت بوده و مشکلات اخلاقی زیادی را در بافت گیری به وجود می آورند. در ابتدا باید توجه داشت که برای استخراج سلول های بنیادی جنینی باید یک جنین در مرحله بلاستوسیست استخراج شود.

در ادامه کلنی سلولی باید بر روی یک لایه مغذی سلولی به نام MEF (Mouse Embryonic Fibroblasts) منتقل شده و کشت داده شود. همچنین محیط کشت مورد استفاده در کشت سلول های بنیادی جنینی می تواند بسیار پرهزینه باشد؛ چرا که وجود انواع فاکتور های رشد برای رشد این سلول ها مورد نیاز است.

از طرفی تست های تأییدی سلول های بنیادی جنینی می تواند بسیار سنگین و پر هزینه باشد. اگرچه توانایی تمایز با پتانسیل بالای این سلول ها می تواند یک مزیت حساب شود اما از طرفی همین پتانسیل بالا احتمال تشکیل تراتوما و سرطانی شدن را در پیوند افزایش می دهد.

مشکلات اخلاقی استخراج سلول های بنیادی جنینی باعث شد یک دانشمند ژاپنی در سال 2006 این سلول ها را از سلول های تمایز یافته تولید کند. یکی از روش های تولید ESC، انتقال هسته یک سلول تمایز یافته به یک سلول تخمک بدون هسته و کاشت آن در رحم جایگزین بود. یعنی برای اینکه ESC اختصاصی یک فرد تولید شود، باید از سلول هایی با هسته کامل استفاده می شد و هسته 2n آن سلول در یک تخمک کاشته می شد.

سپس تخمک هاپلوئید که به شکل مصنوعی تبدیل به سلول زیگوت دیپلوئید شده بود در رحم جایگزین کاشته شده و مجدداً در مرحله مورولا استخراج و کشت داده می شد.

با تلاش های دانشمندی ژاپنی به نام آقای یاماناکا، ژن هایی معرفی شدند که به عنوان master genes عملکرد داشته و با تلقیح آن ژن ها می شود سلول بنیادی پرتوان القائی تولید کرد که از نظر عملکرد همانند سلول های بنیادی جنینی می باشد. در این روش استخراج و تولید سلول های بنیادی، یک سلول فیبروبلاست تمایز یافته از فرد گرفته شده و کشت داده می شود.

سپس با روش های مختلف ترنسداکشن، ترنسفکشن، تغییر اپی ژنتیک و … بیان مجموعه‌ای از ژن ها که شامل Klf4، Sox2، Oct3/4 و c-Myc می باشد، افزایش پیدا کرده و باعث برگشت تمایز و تبدیل سلول عملکردی به سلول بنیادی پرتوان القایی (iPSC) می شود.

امروزه یکی از سلول های بنیادی پرکاربرد در سرتاسر دنیا، سلول های بنیادی بالغ می باشند. زمانی که از سلول های بنیادی بالغ صحبت می شود غالباً منظور سلول های بنیادی مزانشیمی می باشد. این سلول ها در سرتاسر بدن پخش شده و کنام های مختلفی دارند اما در برخی کنام ها حضور پر رنگ تری از خود نشان داده‌اند.

به عنوان مثال در یک فرد بالغ، حضور این سلول ها در مغز استخوان، بافت چربی و ریشه دندان در بیشترین مقادیر خود می باشد. همچنین در بافت های مرتبط با جنین مانند بند ناف، حضور بیشتری دارند. لذا در استخراج این سلول ها با توجه به آسیب وارده به فرد دهنده سلول، باید بافت مناسب برای استخراج حداکثری را در نظر گرفت.

اگرچه مرحله تخلیه بافت مغز استخوان بسیار دردناک بوده و آسیب های جدی به فرد وارد می کند اما به دلیل اتصالات سست بین سلولی، استخراج آن ها از این بافت ساده تر است. با چند بار شست و شو و استفاده از ترکیباتی که گرادیانت شیب گرانشی (مانند فایکول) به وجود می آورند، می توان سلول های بنیادی مزانشیمی را تخلیص کرد.

در بافت های دیگر مانند چربی یا بند ناف که سلول های بنیادی مزانشیمی حضور دارند، اتصالات بین سلولی محکم تر بوده و برای استخراج سلول باید این اتصالات شکسته شوند. ماتریکس خارج سلولی در این بافت ها از نوع کلاژن تایپ ۱ می باشد. لذا برای شکستن اینتگرین های متصل به کلاژن می توان از آنزیم تریپسین استفاده کرد و همچنین برای شکستن رشته های کلاژناز می توان از آنزیم کلاژناز نوع ۱ استفاده کرد.

این بافت ها پس از استخراج باید به خوبی شست و شو داده شوند تا خونبری به شکل کامل انجام شود. سپس تحت تیمار آنزیم های شکننده اتصالات بین بافتی قرار می گیرند تا سلول ها کامل از دل بافت خارج شوند.

پس از تیمار با آنزیم، جهت خنثی کردن اثر آن محیط کشت حاوی FBS به آن اضافه کرده و سانتریفیوژ می شوند. در بافت چربی، در نهایت یک رسوب از جنس Stromal Vascular Fraction یا SVF تشکیل می شود که می توان با کشت دادن آن سلول های بنیادی مزانشیمی را تخلیص کرد.

همچنین بخوانید:

کارآموزی مهندسی بافت و پزشکی بازساختی

نویسنده: مسعود سلطانی حلوائی

نرخ رسوب گلبول قرمز (آزمایش ESR)

نرخ رسوب گلبول قرمز (آزمایش ESR) چیست؟

نرخ رسوب گلبول قرمز (ESR) یک آزمایش خونی رایج برای تشخیص غیراختصاصی التهاب است که ممکن است در اثر عفونت، برخی سرطان‌ها و برخی بیماری‌های خودایمنی ایجاد شود. میتوان آن را به عنوان سرعتی که گلبول‌های قرمز خون (RBCs) در مدت یک ساعت رسوب می‌کند تعریف کرد.

هنگامی که خون حاوی ضد انعقاد در یک لوله شیشه‌ای عمودی باریک برای مدتی قرار بگیرد، گلبول‌های قرمز  تحت تأثیر گرانش از پلاسما جدا می‌شوند. سرعت ته‌نشین شدن آنها به صورت تعداد میلی‌متر پلاسمای شفاف موجود در بالای ستون پس از یک ساعت (mm/hr) اندازه‌گیری می‌شود. این مکانیسم شامل سه مرحله است:

• مرحله تجمع:

مرحله اولیه ای است که در آن تجمع گلبول‌های قرمز انجام می‌شود. این پدیده به شکل گیری رولو معروف است. در ۱۵-۱۰ دقیقه اول رخ می‌دهد.

• مرحله ته نشینی:

مرحله ریزش واقعی گلبول‌های قرمز است که در آن ته نشینی با سرعت ثابت اتفاق می‌افتد و در ۴۰-۳۰ دقیقه از ۱ ساعت رخ می‌دهد.

• مرحله ثابت:

این مرحله نهایی است و به عنوان فاز ثابت نیز شناخته می‌شود. در این مرحله، سرعت پایین‌تری از رسوب وجود دارد و در ۱۰ دقیقه آخر از ۱ ساعت رخ می‌دهد.

روش‌های اندازه‌گیری ESR

دو روش اصلی برای تعیین ESR وجود دارد:

• روش وینتروب
• روش وسترگرن

هر روش نتایج کمی متفاوتی را ایجاد می‌کند. موزلی و بول (1991) به این نتیجه رسیدند که روش وینتروب زمانی که ESR پایین است حساس‌تر است، در حالی که وقتی ESR بالا است، روش وسترگرن ترجیحاً نشانه‌ای از وضعیت بالینی بیمار است.

تصویر 1: لوله Wintrobe برای تست ESR

روش وینتروب

این روش از لوله Wintrobe استفاده می‌کند؛ یک لوله شیشه ای باریک که فقط در انتهای پایین بسته است.

طول لوله وینتروب یازده سانتی‌متر و قطر داخلی ۲.۵ میلی متر است که می‌تواند حاوی ۰.۷ – ۱ میلی لیتر خون باشد.

تست ESR با این روش به صورت زیر انجام می‌شود:

خون و ضد انعقاد را کاملاً مخلوط کنید

1. با استفاده از پیپت پاستور، لوله Wintrobe را تا علامت “0” پر کنید. در خون نباید حباب وجود داشته باشد
2. لوله را به صورت عمودی در پایه ESR به مدت ۱ ساعت دست نخورده قرار دهید.
3. در پایان ۱ ساعت، نتیجه را بخوانید.

 

تصویر ۲: لوله‌ی وسترگرن

روش وسترگرن

این روش بهتر از روش وینتروب است و نتایج به دست‌ آمده با بزرگ‌نمایی لوله واضح‌تر می‌شود.

لوله وسترگرن در دو انتها باز است. طول آن ۳۰ سانتی متر و قطر آن ۲.۵ میلی متر است.

این لوله می‌تواند حاوی حدود ۲ میلی لیتر خون باشد.

مراحل انجام ESR به روش وسترگرن

• خون و ضد انعقاد را کاملاً مخلوط کنید
• با کمک پوار و پیپت خون را تا نقطه صفر به داخل لوله بکشید.
• خون را از پایین لوله با پنبه پاک کنید.
• لوله را در حالت ایستاده قرار دهید ومطمئن شوید که پیپت به خوبی قرار می گیرد تا احتمال نشت از بین برود و پیپت در موقعیت عمودی قرار گیرد
•  لوله را به مدت ۱ ساعت دست نخورده در حالت عمودی قرار دهید
•  در پایان ۱ ساعت، نتیجه را بخوانید.

اهمیت بالینی آزمایش ESR:

میزان رسوب گلبول قرمز (ESR) یک آزمایش غیر اختصاصی است که در طیف وسیعی از شرایط عفونی، التهابی، دژنراتیو و بدخیم مرتبط با تغییرات در پروتئین‌های پلاسما، به ویژه افزایش فیبرینوژن، ایمونوگلوبولین‌ها و پروتئین واکنش‌گر C افزایش می‌یابد. همچنین تحت تأثیر بسیاری از عوامل دیگر از جمله کم خونی، بارداری، هموگلوبینوپاتی‌ها، غلظت خون و درمان با داروهای ضد التهابی نیز قرار می‌گیرد.

علل افزایش قابل توجه ESR

• انواع کم خونی ها به جز کم خونی داسی شکل
• بیماری ها و عفونت های التهابی حاد و مزمن شامل:
  • بیماری HIV
  • بیماری سل
  • هپاتیت حاد ویروسی
  • آرتروز
  • اندوکاردیت باکتریایی
  • بیماری التهابی لگن
  • حاملگی خارج از رحمی
  • لوپوس اریتماتوی سیستمیک
• تریپانوزومیازیس آفریقایی
• لیشمانیوز احشایی
• میلوماتوز، لنفوم، بیماری هوچکینز، برخی تومورها داروها، از جمله داروهای ضد بارداری خوراکی

علل کاهش ESR:

• پلی سیتمی
• پویکیلوسیتوز
• نوزادان تازه متولد شده
• کم آبی بدن
• تب خونریزی دهنده دنگی
• سایر شرایط مرتبط با غلظت خون

تست آنتی‌ گلوبولین مستقیم یا DAT

تست آنتی گلوبولین که به عنوان تست کومبس نیز شناخته می‌شود، یک روش آزمایشگاهی ایمنی شناسی است که برای تشخیص وجود آنتی بادی علیه گلبول‌های قرمز در گردش خون (RBCs) در بدن استفاده می‌شود. تخریب این گلبول‌های قرمز (RBC) از نظر تشخیصی به عنوان کم‌خونی همولیتیک خودایمنی (AIHA) توصیف می‌شود.

آزمایش آنتی گلوبولین به دو زیرگروه آزمایش مستقیم آنتی گلوبولین (DAT) و آزمایش آنتی گلوبولین غیر مستقیم (IAT) باشد.

آزمایش آنتی گلوبولین مستقیم (DAT) یک تست آزمایشگاهی است که ایمونوگلوبولین و یا اجزا کمپلمان را روی سطح گلبول‌های قرمز تشخیص می‌دهد. کاربرد DAT طبقه بندی همولیز به یک علت ایمنی یا غیر ایمنی است. مانند همه آزمایش‌ها، نتایج DAT باید در کنار سایر داده‌های بالینی و سایر آزمایش‌ها بررسی شود. DAT می‌تواند به طبقه‌بندی علل همولیز کمک کند، از جمله کم خونی همولیتیک خودایمنی، همولیز مرتبط با انتقال خون، بیماری همولیتیک جنین/نوزاد، کم‌خونی همولیتیک ناشی از دارو.

واکنش‌های کاذب ممکن است با تکنیک نامناسب، از جمله شستشوی نامناسب، سانتریفیوژ کردن، و هم زدن نمونه در زمان تفسیر نتیجه رخ دهد. عوامل مرتبط با شرایط بیمار، مانند آگلوتیناسیون خود به خود گلبول‌های قرمز نیز ممکن است در نتایج نادرست نقش داشته باشند.

چندین پلتفرم برای انجام DAT وجود دارد از جمله روش معمولی (CTT) و روش‌های حساس‌تر با استفاده از ستون ژل و فاز جامد.

تست DAT با استفاده از خون مخلوط شده با ضد انعقاد EDTA انجام می شود که اتصال کمپلمان به RBC را در شرایط آزمایشگاهی مهار می‌کند و تشخیص تنها به بررسی اتصال آنتی بادی و اجزا کمپلمان که در داخل صورت گرفته را تضمین می کند. در روش CTT، RBC بیمار با سالین شستشو داده می‌شود تا ایمونوگلوبولین و اجزا کمپلمان غیر متصل شده حذف شود، در مرحله ‌ی بعد AHG (Anti Human Globulin) اضافه می‌شود و سوسپانسیون RBC سانتریفیوژ می‌شود.

با استفاده از ضربه ملایم، پلت RBC از جای خود خارج می‌شود و از نظر آگلوتیناسیون بررسی می‌شود، که در مقیاسی از 0 که نشان دهنده عدم آگلوتیناسیون است تا 4+ که نشان دهنده آگلوتیناسیون است درجه بندی می‌شود.

در روش ستون ژل، RBC از طریق یک ماتریس ژلاتینی مخلوط با معرف‌های AHG فیلتر می‌شود. ژل، گلبول‌های قرمز آگلوتینه شده را به دام می‌اندازد و گلبول‌های قرمز غیر آگلوتینه شده از ستون عبور می کند. سنجش فاز جامد امکان تفسیر نتایج را با استفاده از اسپکتروفتومتر به روش خودکار فراهم می‌کند.

تصویر ۳: روش‌های انجام تست DAT

مانند تمام تست ها، DAT می‌تواند به طور کاذب منفی یا مثبت باشد. شایع‌ترین دلایل نتایج منفی کاذب، شستشوی نامناسب یا سانتریفیوژ نکردن نمونه است که اجازه می‌دهد تا آنتی بادی‌های غیر متصل باقی مانده در لوله توسط معرف AHG جذب شده و دیگر جایگاهی برای اتصال به آنتی بادی‌های پوشاننده RBC وجود نداشته باشد.

عدم افزودن معرف‌های AHG یا افزودن معرف‌های AHG غیر فعال به دلیل نگهداری و جابجایی نامناسب نیز ممکن است منجر به نتایج منفی کاذب شود. همچنین تأخیر در افزودن AHG پس از شستشو نیز می‌تواند باعث منفی شدن کاذب شود.

علل نتایج مثبت کاذب در اثر سانتریفیوژ بیش از حد است که باعث می‌شود RBC خیلی محکم به یکدیگر متصل شود. همچنین تاخیر طولانی مدت در انجام آزمایش، نمونه لخته شده، مشکلات معرف، و عوامل بیمار مانند آگلوتیناسیون خود به خودی نیز باعث ایجاد مثبت کاذب می‌شود.

کاربرد‌های بالینی تست DAT

• کم خونی همولیتیک خودایمنی (علل اولیه و ثانویه)
  1. کم خونی همولیتیک خود ایمنی گرم
  2. کم خونی همولیتیک خود ایمنی سرد
  3. کم خونی همولیتیک خودایمنی مختلط
  4. هموگلوبینوری سرد حمله ای
• مربوط به انتقال خون
  1. واکنش حاد همولیتیک انتقال خون
  2. واکنش همولیتیک تاخیری
  3. واکنش سرولوژیکی تاخیری
  4. انتقال غیر فعال آنتی بادی از طریق انتقال خون
• بیماری همولیتیک جنین/نوزاد
• سندرم لنفوسیت مسافر
• کم خونی همولیتیک ناشی از دارو
• تزریقایمونوگلوبولین داخل وریدی
• Rh0(D)

موارد مثبت کاذب

1. 1. آگلوتیناسیون خودبه‌خودی گلبول‌های قرمز
   2. ژله وارتون در نمونه‌های خون بند ناف
   3. تکنیک شستشو ضعیف
   4. سانتریفیوژ بیش از حد
   5. نمونه های لخته شده

موارد منفی شامل:

• همولیز غیر ایمیون
• کم خونی همولیتیک ناشی از دارو
• همولیز ناشی از ایمونوگلوبولین IgA یاIgM
• سطح پایین آنتی بادی
• آنتی بادی میل ترکیبی پایین
• موارد منفی کاذب
  1. عدم اضافه کردن یا تأخیر در افزودن معرف ضد گلوبولین ضد انسانی(AHG)
  2. مشکل در معرف AHG

در مقابل، IAT برای تشخیص آنتی بادی‌های غیر متصل به گلبول‌های قرمز، که ممکن است در سرم بیمار وجود داشته باشد، استفاده می‌شود. برای آزمایش آنتی گلوبولین غیرمستقیم، سرم از نمونه خون جدا می‌شود و گلبول‌های قرمز فرد حذف می‌شود.

سپس نمونه سرم جدا شده با گلبول‌های قرمز خارجی انکوبه می‌شود. برای آزمایش آنتی گلوبولین غیرمستقیم، سرم از نمونه خون جدا می‌شود و گلبول‌های قرمز حذف می‌شود. سپس نمونه سرم ایزوله شده با گلبول‌های قرمز خارجی که دارای آنتی ژن شناخته شده هستند انکوبه می‌شود. سپس معرف آنتی گلوبولین اضافه می‌شود و وجود آگلوتیناسیون نشان دهنده یک نتیجه مثبت است.

گزارش نتایج آزمایش کومبس می‌تواند کیفی یا کمی باشد. برای روش‌های کیفی، آزمایشگر لوله آزمایش را بررسی می‌کند و بر اساس مقیاس درجه‌بندی شده، امتیازی را در نظر می‌گیرد:

M: واکنش Mix field – هر درجه‌ای از آگلوتیناسیون در توده ‌ای از سلول‌های غیر آگلوتینه

W: اگریگیت‌های ریز در پس زمینه مایل به قرمز کدر

+۱ : اگریگیت‌های کوچک در پس زمینه مایل به قرمز کدر

+۲: اگریگیت‌های کوچک تا متوسط در پس زمینه روشن

+۳: چندین اگریگیت بزرگ در پس زمینه روشن

+۴: تجمع یا توده سلولی

در بیماران مبتلا به کم خونی همولیتیک خودایمنی، درجه آگلوتیناسیون معمولاً با شدت همولیز ارتباط دارد. در صورت عدم وجود آگلوتیناسیون ماکروسکوپی، نمونه به صورت میکروسکوپی بررسی می‌شود تا از عدم وجود اگریگیت اطمینان حاصل شود.

موارد مثبت کاذب:

1. پروتئین سرم بالا در بیماری‌های خاص، مانند بیماری‌های میلوپرولیفراتیو، ممکن است به دلیل سطوح بالای غیرعادی پروتئین غیرمرتبط با آگلوتیناسیون آنتی بادی-RBC، باعث ایجاد آگلوتیناسیون مثبت کاذب شوند. منابع خارجی پروتئین یا ایمونوگلوبولین اضافی، مانند مواردی که در آن بیمار گلوبولین ایمونوگلوبولین داخل وریدی (IVIG) دریافت می‌کند، ممکن است منجر به یک مطالعه مثبت کاذب شود.
2. عفونت – سرم افراد آلوده به میکروارگانیسم‌های خاص ممکن است یک نتیجه آگلوتیناسیون مثبت کاذب ایجاد کند. به عنوان مثال می‌توان به ویروس نقص ایمنی انسانی (HIV)، مالاریا، ویروس HCV (هپاتیت نوع C) و در موارد نادر، ویروس هپاتیت E (HEV) اشاره کرد.
3. سندرم آنتی فسفولیپید – واکنش متقابل بین آنتی بادی‌های آنتی فسفولیپید و غشاهای RBC می‌تواند منجر به آزمایش DAT مثبت کاذب شود، همانطور که Win و همکاران گزارش کرده‌اند.
4. ژله وارتون – در نمونه‌های خون بند ناف نوزادان، وجود ژله وارتون غنی از موکوپلی ساکارید می‌تواند نتایج آنتی گلوبولین مثبت کاذب را ایجاد می‌کند.

مطالب مرتبط:

• کارآموزی هماتولوژی

• شاخص های گلبول قرمز

رتیکولوسیت‌ چیست؟ نحوه شمارش رتیکولوسیت‌

مقدمه‌ای بر رتیکولوسیت‌ ها

رتیکولوسیت گلبول‌های قرمز خون نسبتاً نابالغ هستند (RBC) که به تازگی تولید شده‌اند. شمارش رتیکولوسیت بازتابی از عملکرد یا فعالیت اخیر مغز استخوان در روند خونسازی است.

از شمارش این گلبول‌ها برای بررسی موارد زیر استفاده می‌شود:

• به عنوان پیگیری نتایج غیرطبیعی در شمارش کامل خون (CBC)، شمارش RBC، هموگلوبین یا هماتوکریت
• برای کمک به تعیین علت برای تعیین اینکه آیا مغز استخوان به درستی کار می کند و به میزان کافی به نیاز بدن به گلبول های قرمز پاسخ می دهد یا خیر
• برای کمک به تشخیص و تمایز بین انواع مختلف کم خونی
• برای نظارت بر پاسخ به درمان، مانند آنمی فقر آهن
• برای نظارت بر عملکرد مغز استخوان پس از درمان هایی مانند شیمی درمانی
• برای نظارت بر عملکرد مغز استخوان پس از پیوند مغز استخوان

برخلاف اکثر سلول‌های دیگر بدن، گلبول‌های قرمز بالغ هسته ندارند، اما رتیکولوسیت‌ها هنوز مقداری ماده ژنتیکی باقی‌مانده (RNA) دارند. همانطور که رتیکولوسیت ها بالغ می شوند، آخرین RNA باقیمانده را از دست می دهند و بیشتر آنها در عرض یک روز پس از آزاد شدن از مغز استخوان در خون، به طور کامل بالغ می شوند.

شمارش رتیکولوسیت ها شاخص خوبی از توانایی مغز استخوان شما برای تولید گلبول های قرمز (اریتروپویزیس) موثراست. گلبول‌های قرمز معمولاً حدود ۱۲۰ روز در گردش خون زنده می‌مانند و مغز استخوان به طور مداوم گلبول‌های قرمز جدیدی تولید می‌کند تا جایگزین آنهایی شود که پیر می‌شوند و تحلیل می‌روند یا در اثر خونریزی از بین می‌روند. به طور معمول، تعداد ثابتی از گلبول های قرمز از طریق جایگزینی مداوم گلبول های قرمز تخریب شده یا از دست رفته در خون حفظ می شود

انواع بیماری‌ها و شرایط می‌توانند بر تولید گلبول‌های قرمز جدید ویا بقای آنها تأثیر بگذارند، علاوه بر آن شرایطی که ممکن است منجر به خونریزی و از دست رفتن گلبول‌های قرمز شود. این شرایط ممکن است منجر به افزایش یا کاهش تعداد گلبول های قرمز شود و ممکن است بر تعداد رتیکولوسیت ها تأثیر بگذارد. تعداد رتیکولوسیت های بالاتر از حد طبیعی ممکن است در شرایط زیر دیده شود:

• خونریزی حاد یا مزمن (خونریزی)
• افزایش تخریب گلبول های قرمز (همولیز) می تواند منجر به کاهش گلبول های قرمز در خون و در نتیجه کم خونی شود.
• برخی از کم خونی‌ها

بدن این فقدان را با افزایش سرعت تولید گلبول های قرمز جبران می کند و گلبول های قرمز را زودتر قبل از بالغ شدن در خون آزاد می کند. وقتی این اتفاق می‌افتد، تعداد و درصد رتیکولوسیت‌ها در خون افزایش می‌یابد تا زمانی که تعداد کافی از گلبول‌های قرمز جایگزین گلبول‌های قرمز از دست رفته شود یا تا زمانی که ظرفیت تولید مغز استخوان به میزان بالاتر از حد نرمال برسد. تعداد رتیکولوسیت ها نیز زمانی که بیمار مبتلا به کم خونی فقر آهن یا کم خونی مگالوبلاستیک بیشتر از حد طبیعی است.

شمارش

شمارش رتیکولوسیت ها که به عنوان درصدی از کل گلبول های قرمز گزارش شده است، در طبقه بندی کم خونی‌ها ضروری است. افزایش تعداد این گلبول‌ها نشان دهنده پاسخ مغز استخوان به افزایش تخریب RBC (همولیز) یا از دست دادن خون حاد یا مزمن است. در موارد از دست دادن خون حاد، به طور متوسط ۳-۴ روز تاخیر در پاسخ مغز استخوان وجود دارد.

چرخه همولیز

بنابراین، در شرایط از دست دادن خون حاد، شمارش رتیکولوسیت ها زمانی مفیدتر است که خونریزی و کم خونی متعاقب آن برای بیش از چند روز وجود داشته باشد. کم خونی ها بر اساس کفایت پاسخ رتیکولوسیتی طبقه بندی می شوند. تعداد رتیکولوسیت ها به صورت درصدی از تعداد کل گلبول های قرمز بیان می شود.

در تنظیم هموگلوبین طبیعی، تعداد رتیکولوسیت ها حدود ۱-۲٪ است. در بیماران مبتلا به کم خونی متوسط یا شدید، تعداد رتیکولوسیت ها ممکن است افزایش یافته باشد، اما به صورت مطلق، ممکن است برای درجه کم خونی کافی نباشد.

شمارش رتیکولوسیت یکی از چندین آزمایشی است که می تواند به پزشک شما کمک کند که کدام نوع کم خونی وجود دارد:

 کم خونی آپلاستیک:

تعداد رتیکولوسیت های شما کم است. این بدین معنا است که مغز استخوان شما به اندازه کافی گلبول های قرمز نمی سازد.

کم خونی همولیتیک:

در این نوع کم خونی تعداد رتیکولوسیت‌ها زیاد است. در این نوع کم خونی گلبول های قرمز خون زودتر از اتمام عمر طبیعی خود از بین می روند، بنابراین مغز استخوان مجبور است برای جایگزینی آنها اضافه کاری کند

کم خونی فقر آهن:

تعداد کم رتیکولوسیت نشانه این  آنمی است. زمانی اتفاق می افتد که بدن آهن کافی برای ساخت گلبول های قرمز ندارد.

کم خونی مگالوبلاستیک:

بدن شما ویتامین B12 کافی دریافت نمی کند و همچنین تعداد رتیکولوسیت های کمی تولید می کند.

نحوه‌ی شمارش رتیکلوسیت:

اغلب، شمارش رتیکولوسیت ها با یک ابزار خودکار (آنالایزر هماتولوژی) انجام می شود و می توان همزمان با CBC، که شامل شمارش RBC، هموگلوبین و هماتوکریت است، انجام شود. تعداد مطلق رتیکولوسیت ها و یا درصدی از رتیکولوسیت ها از تعداد کل گلبول های قرمز را می توان گزارش کرد، اگرچه تعداد مطلق آن بیشتر گزارش می شود.

دربررسی و شمارش با میکروسکوپ نوری، نمونه باید ابتدا با رنگ حیاتی رنگ آمیزی شود، که معمولاً با استفاده از متیلن بلو جدید (New Methylene Blue) یا کرسیل بلو درخشان (brilliant cresyl blue) که به RNA متصل می شوند این رنگ‌آمیزی صورت می‌گیرد.

تصویر ۱: رتیکلوسیت‌های موجود در خون محیطی رنگ شده با رنگ‌های حیاتی

به واسطه‌ی این رنگ رتیکلوسیت‌ها به دلیل داشتن RNA در خود رنگ می‌گیرند (تصویر ۱). برای رنگ‌آمیزی رتیکلوسیت‌ها نسبت مساوی خون کامل حاوی ضد انعقاد با رنگ مخلوط شده و در دمای اتاق به مدت ۳ تا ۱۰ دقیقه انکوبه می شود. در مرحله‌ی بعدی اسلایدی از نمونه بر روی لام تهیه شده و زیر میکروسکوپ بررسی می‌شود.

همچنین از صفحات زیر دیدن فرمایید:

• دوره مهارت آموزی هماتولوژی
• خونسازی و شناخت انواع سلول های خونی
• اختلالات گلبول قرمز

 بیشتر بخوانید

چراغ بونزن: عملکرد، قطعات، انواع، دستورالعمل و کاربرد

چراغ بونزن نوعی چراغ گازی است که شعله‌ای ایمن، بدون دود، داغ و بدون نور ایجاد می‌کند که می‌تواند برای آزمایش‌ها و تحقیقات علمی مختلف مورد استفاده قرار گیرد.

در سال 1857، دانشمند آلمانی Robert Bunsen و دستیار آزمایشگاه او پیتر دساگا چراغ بونزن را اختراع کردند و آن را به نام خانوادگی خود نامگذاری کردند. چراغ بونزن یک شعله باز تولید می‌کند که از آن در اشتعال، استریل کردن یا گرم کردن استفاده می‌شود.

شعله نورانی و غیر نورانی دو نوع شعله هستند. هنگامی که سوراخ هوا باز می‌شود، شعله روشن به یک شعله غیر درخشان تبدیل می شود که به صورت یک شعله نارنجی قابل مشاهده است. دما بسیار معتدل است.

علاوه بر این، شعله ناپایدار و سوسو زن به نظر می‌رسد. شعله غیر درخشان، در مقابل، آبی رنگ است. اما نمی‌توان این شعله را به درستی دید. گرمتر و پایدارتر از شعله روشن است.

عملکرد چراغ بونزن

این چراغ معمولا دارای یک بدنه فلزی و یک پایه محکم روی میز می‌باشد. لوله لاستیکی نازل گاز، میز آزمایشگاه را به ورودی گاز اولیه چراغ در پایه آن متصل می‌کند. توانایی گاز (یا سوخت دیگر) برای ترکیب با اکسیژن قبل از اشتعال، به عنوان متال ترکیب شدن گاز با هوا قبل از اشتعال برای عملکرد چراغ بونزن بسیار مهم است.

این کار توسط مکیده شدن هوا از طریق شیر ورودی و با کمک اثر ونتوری در پایین ستون چراغ که با فعال شدن نازل گاز آزمایشگاهی انجام می‌شود. قطر نازل متناسب با نوع گاز مورد استفاده است. لوله عمودی بالای ورودی گاز دارای چند سوراخ کوچک است که اجازه می‌دهد هوا از طرفین وارد و با گاز ترکیب شود. گاز پس از روشن شدن با فندک یا کبریت در بالای چراغ می‌سوزد.

شیر قابل تنظیم در پایین (بست) میزان اکسیژن اضافه شده به مخلوط را کنترل می‌کند. هوای کمتر باعث شعله ضعیف‌تر می‌شود، در حالی که هوای بیشتر باعث قوی‌تر شدن شعله می‌شود. از رنگ شعله می‌توان برای تعیین میزان اشتعال آن استفاده کرد. سوراخ هوا یا بست را می توان برای تولید شعله به رنگ های مختلف تنظیم کرد.

برای مثال،

• با بسته شدن کامل سوراخ هوا شعله، رنگ زرد از خود ساطع می‌کند (ایمنی در برابر آتش.)
• با باز شدن مقدار کمی از سوراخ هوا، شعله‌ای قرمز رنگ ظاهر می‌شود (شعله کوچک است.)
• شعله بنفش هنگامی ایجاد می‌شود که سوراخ هوا تا حدی باز شود (شعله به اندازه ی نصف حد معمول است.)
• هنگامی که سوراخ هوا به طور کامل باز شود شعله آبی ظاهر می‌شود (شعله کامل و خطرناک است).

تصویر: انواع شعله های تولید شده در هنگام تنظیم سوراخ هوا در چراغ بونزن.

 

قطعات چراغ بونزن با عملکرد آن‌ها

چراغ بونزن از قطعات مختلفی تشکیل شده است که عبارتند از:

• پایه : چراغ بونزن توسط پایه نگه داشته می‌شود،

  اجزای چراغ بونزن

  یک قسمت پهن و قوی که در اشکال مختلف وجود دارد. به یک لوله جانبی معروف به لوله گاز متصل است. همچنین کمک می‌کند که چراغ روی میز قرار بگیرد.

• لوله: یک لوله فلزی عمودی متصل به پایه به طول حدود ۱۳ سانتی‌متراست. دارای یک دریچه هوا در نزدیکی قسمت پایینی می‌باشد که بین سوراخ‌های مخالف قرار گرفته است. لوله را می‌توان با پیچ به پایه محکم بست. در انتهای بالاتر نازل، گاز پس از ترکیب شدن با هوای دریچه می‌سوزد.
• بست: پایه و لوله را به هم وصل می‌کند. این یک قطعه فلزی استوانه‌ای کوچک با دو سوراخ است که در مقابل یکدیگر قرار دارند. میزان هوای ورودی به بشکه را تنظیم می‌کند.
• سوراخ‌های هوا: سوراخ‌های هوا در بست به هوا اجازه می‌دهد تا وارد چراغ شود تا ترکیبی از هوا و گاز یا هر سوخت مایع با هوا ایجاد شود.
• شیر گاز: جریان گاز را کنترل می‌کند.
• مکش گاز: از یک لوله لاستیکی برای اتصال به منبع گاز در میز آزمایشگاه استفاده می‌کند.

منابع سوخت چراغ بونزن

دو منبع سوخت اولیه برای چراغ بونزن گاز طبیعی (بیشتر متان) و گاز مایع (پروپان، بوتان یا مخلوطی از این دو) هستند. چراغی که برای یک نوع سوخت استفاده می‌شود هرگز نباید با نوع دیگری از سوخت استفاده شود. بنابراین، انتخاب صحیح چراغ بونزن با توجه به منبع سوخت ضروری است.

انواع چراغ بونزن

چراغ Meker Fisher

سه نوع چراغ بونزن عبارتند از:

چراغ مکر فیشر (Meker Fisher)

در این چراغ لوله قطر بزرگ‌تری دارد. به دلیل اندازه بزرگ‌تر، ترکیب هوا و گاز بیشتری درون لوله وجود دارد. دریچه ای که شعله را به شعله های کوچکتر تقسیم می‌کند در بالای لوله قرار می‌گیرد. یک شیر گاز واقع در زیر لوله می‌تواند برای تنظیم جریان گاز استفاده شود.

 

چراغ تکلو (Teclu)

این چراغ به طور موثر گرمای بیشتری تولید می‌کند. لوله بلندتری نسبت به چراغ‌های دیگر دارد. هوا و گاز کاملاً ترکیب می‌شوند. در نتیجه قدرت اشتعال شعله افزایش می‌یابد. علاوه بر این، لوله دارای یک مهره پیچ برای تنظیم منبع گاز است.

مشعل تیریل (Tirril)

در پایه لوله، دارای یک دریچه دیسکی است که می تواند میزان جریان گاز را به مشعل تنظیم کند.

انواع رنگ شعله چراغ بونزن

شعله زرد

از آن به عنوان شعله ایمنی یاد می‌شود زیرا در یک فضا به راحتی قابل مشاهده است. می توان آن را زمانی تولید کرد که سوراخ هوا کاملاً بسته باشد و دمای آن به حدود ۳۰۰ درجه برسد.

شعله آبی

هنگامی که سوراخ هوا تا نیمه باز است، دیدن آن در یک محیط روشن آسان نیست. چنین شعله ای به شعله آبی معروف است که دمای آن به ۵۰۰ درجه می‌رسد.

شعله آبی خروشان

این داغ ترین شعله‌ای است که وقتی سوراخ هوا کاملاً باز است تولید می‌شود و می‌تواند به دمای ۷۰۰ درجه برسد.

دستور عمل استفاده از چراغ بونزن

1. از پیش‌بند آزمایشگاهی و عینک ایمنی استفاده کنید. اگر کسی موهای بلندی دارد باید از پشت بسته شود.
2. لوله لاستیکی باید به شیر گاز وصل شود.
3. برای ایمنی بیشتر، هنگامی که چراغ را روی سطحی که عایق حرارتی ندارد می‌گذارید یک عایق حرارتی را در زیرچراغ قرار دهید.
4. یک سرپوش برای سوراخ هوا باید روی بست قرار داده شود.
5. ۳ سانتی متر بالاتر از قسمت بالایی لوله، یک کبریت روشن کنید و آن را نگه دارید.
6. در موقعیت روشن، شیر گاز را بچرخانید.
7. وقتی چراغ روشن شد کبریت را خاموش کنید.
8. تا زمانی که نیاز به گرم کردن چیزی ندارید، شعله را در “حالت ایمنی” بگذارید.

کاربردهای چراغ بونزن

• برای استریل کردن حلقه‌ها، سوزن‌ها و شعله‌ور کردن دهانه لوله‌های آزمایش در حین تلقیح، بیشتر در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی استفاده می‌شود.
• از کاربرد گرمایشی این چراغ‌ها، بیشتر در آزمایشگاه‌های شیمیایی استفاده می‌شوند.
• در آبزدایی کمپلکس‌ها، نمک سود کردن، تجزیه و تحلیل میزان رطوبت و شناسایی آب تبلور استفاده می‌شود.
• این چراغ به تعیین نقطه ذوب با استفاده از کالریمتری کلاسیک و نقطه جوش با استفاده از روش لوله تیل کمک می‌کند.
• برای اشتعال پذیری ترکیبات و نقطه اشتعال حلال‌ها استفاده می‌شود.

مزایای چراغ بونزن

• رسیدگی به آن بسیار آسان است.
• می‌توان از آن در هر جایی که به گاز دسترسی داشته باشد (گاز زغال سنگ، گاز طبیعی و غیره) استفاده کرد.
• مشعل در اندازه‌های مختلف موجود است، بنابراین ما ممکن است بر اساس کاربرد مورد نظر یکی را انتخاب کنیم .
• علاوه بر گرم کردن، می‌توانیم از آن برای کارهای اولیه شیشه گری و هوا خشک استفاده کنیم.
• چراغ ممکن است با سوخت‌های کم هزینه مانند گاز زغال سنگ و گاز طبیعی کار کند. این به ابزارهای پیچیده زیادی نیاز ندارد.
• با توجه به ورودی هوای قابل تنظیم، می‌توانیم شعله‌هایی با محدوده دما به دست آوریم.
• یک جریان همرفتی را می‌توان با گرمای شعله چراغ بونزن تولید کرد که ناحیه بالای شعله را گرم می‌کند و ذرات معلق در هوا را از هوای سردتر زیر آن حذف می‌کند و این ناحیه کار را استریل نگه می‌دارد.

محدودیت های چراغ بونزن

• خطر دائمی آتش سوزی وجود دارد.
• حفظ درجه حرارت در محدوده مورد نظر دشوار است.

تمهیدات لازم

این نوع تجهیزات قابل اشتعال هستند و در دمای بسیار بالا می‌سوزند و در صورت عدم استفاده آگاهانه ممکن است منجر به حادثه شود. نکات زیر در هنگام کار با چراغ بونزن به شرح زیر است:

• ما باید در فضایی عاری از اشیاء اضافی مانند دفترچه، کاغذ و … کار کنیم.
• موهای بلند باید به پشت بسته شود و از پوشیدن لباس های گشاد یا جواهرات خودداری شود.
• همیشه به دنبال ترک ها، سوراخ ها یا سایر عیوب در لوله لاستیکی باشید که می تواند منجر به نشتی شود. هر شیلنگ یا لوله ای که شکسته است باید تعویض گردد.
• برای روشن کردن چراغ بونزن به جای کبریت از فندک با نازل منبسط شده استفاده کنید.
• قبل از باز کردن شیر گاز، فندک خود را آماده کنید. اگر از شعله استفاده نمی‌شود، باید در حالت ایمنی بماند.
• حتی با روشن بودن شعله ایمنی، چراغ بونزن را هرگز نباید رها کنید.
• پس از اتمام آزمایش، بلافاصله گاز را خاموش کنید.
• از دست زدن به تجهیزات در حالی که هنوز گرم است خودداری کنید و بگذارید پس از استفاده کاملاً خنک شود.

نمونه‌هایی از چراغ بونزن

الف: چراغ بونزن دارای محافظ (FIREBOY Safety Bunsen Burner) سازنده: بیوساینس اینتگرا

ویژگی‌ها

• با نظارت بر شعله نشتی گاز را متوقف می‌کند
• به علت داشتن اشتعال خودکار، به فندک یا کبریت نیازی ندارد
• آداپتورهای کارتریج گاز: مستقل از هر سیستم انتقال گاز
• نیرو اختیاری: به هیچ منبع تغذیه خارجی نیاز نیست.

 

 

ب: بونزن برگرفته شده از مدل بونزن اصلی Bunsen acc. to Bunsen  (سازنده: مارین فیلد)

ویژگی‌ها

• از مواد ضد زنگ تشکیل شده است
• قطعه تنظیم هوای آب کاری شده توسط نیکل،
• شیر سوزنی برای انتخاب نوع گاز
• هم گاز طبیعی و هم پروپان می توانند به عنوان منبع سوخت مناسب باشند

ج: چراغ بونزن آزمایشگاهی مدل 4056/B  (سازنده: تکنو گاز)

ویژگی‌ها

• یک نازل جامع جدید که امکان استفاده از آن را با هر نوع گاز GPL و در هر فشاری فراهم می‌کند.
• یک شیر انسداد و یک واحد حسگر ترموکوپل را تشکیل می‌دهند. این ترموکوپل یک مکانیسم ایمنی است که در صورت خاموش شدن شعله جریان گاز را قطع می‌کند و از اشباع گاز در محیط جلوگیری می‌کند.

 

چراغ بونزن آزمایشگاهی سری BEC2 (سازنده: مدلاین ساینتیفیک)

ویژگی‌ها

• جایگزینی برای مشعل‌های گازی مرسوم بونزن که خاص و ایمن است
• یک جریان متمرکز از حرارت برابر با چراغ‌های بونزن گازی موجود با خاصیت گرمادهی با توان بالا همراه با یک کاسه فولاد ضد زنگ انعکاس دهنده تولید می‌شود.
• همراه با محافظ ایمنی سیم، پایه پشتی و بست.
• کاسه داخلی فولاد ضد زنگ با خاصیت انعکاس می‌باشد.

 

 

همچنین بخوانید:

• دوره مهارت آموزی میکروبیولوژی
• لوله های اپندورف
• لوله فالکون

 

منبع

مترجم: دیبا ضابطی

آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلول: از کجا می‌آید و چگونه از آن جلوگیری کنیم؟

اگر در حال خواندن این مقاله هستید، احتمالاً به آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلولی خود مشکوک هستید یا می‌خواهید یک پروژه کشت سلولی جدید را آغاز کنید. اگر مایکوپلاسما در آزمایشگاه شما وجود دارد، تعجب نکنید. آنها در اکثر تجهیزات کشت سلولی وجود دارند. آزمایشگاه‌های کشت بافت و هر کشت دهنده سلول باید با این مشکل مقابله کند. تخمین زده میشود که مایکوپلاسما مسئول ۶۰ درصد آلودگی در کشت سلولی است. مایکوپلاسماها یکی از ساده‌ترین و کوچکترین باکتری‌ها هستند.

عدم وجود دیواره سلولی سفت و سخت باعث می‌شود که آنها در برابر آنتی‌بیوتیک‌ها و داروهای ضد باکتریایی مانند پنی سیلین و استرپتومایسین مقاوم شوند. مایکوپلاسما به دلیل توانایی آن در تغییر شکل و عدم وجود دیواره سلولی سفت و سخت می‌تواند از روش‌های فیلتراسیون عبور کند. در این جا، برخی از بهترین راه‌ها را برای مقابله با آلودگی مایکوپلاسما قبل از این که به کشت سلولی وارد شوند و آن‌چه که در صورت مواجهه با آلودگی مایکوپلاسما باید انجام دهید را توضیح خواهیم داد.

علل آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلول

ورود مایکوپلاسماها به کشت سلولی منشاءهای مختلفی دارد که ردیابی آنها دشوار است. این منشاءها می‌توانند پرسنل آزمایشگاه، سرم، محیط کشت سلولی، حمام‌های آب (Water bath)، انکوباتورها (Incubator) و غیره باشند. آلودگی توسط انسان بزرگترین منشاء آلودگی در میان موارد ذکر شده در بالا است.

این آلاینده‌ها می‌توانند از طریق لباس‌های کثیف، لباس‌های آزمایشگاهی، صحبت کردن در جایی که جریان هوای لامینار (Laminar airflow) وجود دارد، پوست سر انسان، عطسه، سرفه و غیره پخش شوند. همچنین ورود مداوم افراد در جایی که کشت‌های سلولی نگهداری می‌شوند، خطر آلودگی را افزایش می‌دهد. مایکوپلاسما می‌تواند از طریق آلودگی متقاطع (Cross-contamination) و به دلیل روش‌های کاری نادرست آزمایشگاهی (شامل استفاده مجدد از پیپت برای چندین رده سلولی به جای استفاده از انواع یکبار مصرف آن یا استفاده مجدد از دستکش)، از این منابع پخش شود. سرم‌ها هم منبع آلودگی به مایکوپلاسما است.

به دلیل ماهیت کدر آن، تشخیص آلودگی در سرمی که معمولاً برای هر کشت سلولی استفاده میشود، دشوار است. استفاده مجدد از یک بطری سرم برای هر زیرکشت میتواند رشد مایکوپلاسما را افزایش دهد. این سرم غنی از مواد مغذی و بهترین منبع برای تکثیر مایکوپلاسما است. بعلاوه سرم پس از اتوکلاو (Autoclave) به محیط اضافه میشود، از این رو، هیچ اطمینانی در مورد آلوده نبودن سرم وجود ندارد. آئروسل‌هایی (Aerosol) که در حین کار در جریان هوای لامینار تولید میشوند (هنگام صحبت یا پیپت کردن) نیز از جمله دلایل اصلی آلودگی هستند.

اگر رده سلولی برای مدت طولانی‌تری در معرض هوا بماند، این آئروسل‌های تولید شده یا در طی فرآیندهای زیرکشت یا از هوا وارد محیط کشت میشوند. آئروسل‌ها با چشم غیرمسلح قابل دیدن نیستند، بنابراین تا زمانی که منجر به آلودگی نشوند، قابل شناسایی نیستند.

یک منبع دیگر آلودگی، محیط‌های مورد استفاده برای زیرکشت است که به دو صورت مایع و پودری موجود است. به دلیل استفاده نادرست یا روش‌های کاری نادرست آزمایشگاهی، مایکوپلاسما میتواند در این محیط‌های پودری پخش شود. فیلتراسیون گندزدایی کامل را تضمین نمی‌کند زیرا مایکوپلاسما حتی می‌تواند از فیلترهای ۰.۲ میکرونی عبور کند.

شکل 1: آلودگی! محیط‌های کشت بافت اغلب نشانگرهایی در محیط دارند که با کاهش pH به دلیل آلودگی میکروبی زرد می‌شوند.

مایکوپلاسماها می‌توانند برای مدت طولانی‌تری در محیط خشک باقی بمانند. هنگامی که در تماس با یک منبع مغذی قرار میگیرند، در مدت کوتاهی شروع به تکثیر می‌کنند. هنگامی که آنها در محیط آزمایشگاه وجود دارند، از بین بردن آنها به طور کامل دشوار است. شما می‌توانید مانع رشد مایکوپلاسماها شوید اما نمی‌توانید آن را به طور کامل از بین ببرید. هنگامی که مایکوپلاسما در کشت مشاهده شد، دور انداختن فلاسک‌ها (Flask) گزینه خوبی است (مگر اینکه منبع کشت غیر قابل تعویض یا بسیار گران باشد).

تشخیص آلودگی مایکوپلاسما

یافتن مایکوپلاسما با چشم غیرمسلح یا به وسیله میکروسکوپ نوری می‌تواند بسیار دشوار باشد، بنابراین چگونه از کجا بدانیم آلودگی وجود دارد؟ برای این کار، می‌توانید از تشخیص مبتنی بر PCR (Polymerase Chain Reaction)، رنگ‌آمیزی DNA، برچسب‌گذاری فلورسنت، ظرف آگار (Agar plate) و غیره استفاده کنید. در ادامه تکنیک‌هایی ذکر شده و شما باید هر کدام که مناسب­تر است را برای تشخیص آلودگی انتخاب کنید و همیشه برای اطمینان ۱۰۰% از یک آزمایش دوم هم استفاده کنید.

قبل از آزمایش مایکوپلاسما، سلول­‌ها باید حداقل به مدت دو هفته در کشت پیوسته (Continuous culture) باشند تا زمان کافی برای رشد سطوح پایین آلودگی‌­ها فراهم شود. برای آزمایش، حداقل دو یا سه روز قبل از نمونه برداری نباید محیط را تغییر داد.

• کشت بر روی ظروف آگار یا محیط کشت براث (Broth) به عنوان “استاندارد طلایی” برای تشخیص مایکوپلاسما در نظر گرفته می­شود. در این روش، مایع رویی حاصل از کشت سلولی به محیط مایع یا نیمه جامد (حاوی مواد مغذی ضروری برای رشد مایکوپلاسما) اضافه می­شود. کشت سلولی که آلوده باشد، هم در براث و هم در ظروف آگار رشد مایکوپلاسما را نشان می­دهد و کلنی‌­های مایکوپلاسما به راحتی در ظروف آگار قابل مشاهده هستند. این روش قادر است بیشتر گونه­‌های مایکوپلاسما را به غیر از تعداد کمی از آن­ها شناسایی کند.
• روش دیگری که برای تشخیص آلودگی مایکوپلاسما استفاده می­شود استفاده از PCR است. در این روش از پرایمرهای PCR مخصوص ژن­‌های RNA ریبوزومی ۱۶ سوودبرگ (16S rRNA gene) مربوط به مایکوپلاسماهای مختلف استفاده می‌شود. طیف وسیعی از این پرایمرها تقریباً تمام مایکوپلاسمای عفونی کننده را شناسایی می­کنند. پرایمرهای مورد استفاده در این فرآیند یا مخصوص یک گونه یا ژن هستند یا برای انواع مایکوپلاسما عمومیت دارند. این روش سریع، کارآمد، قابل اعتماد و مقرون به صرفه است.
• روش حسگر مبتنی بر سلول از سلول‌­های مخصوصی استفاده می­کند که می‌­توانند وجود مایکوپلاسما را در کشت تشخیص دهند. هنگامی که این سلول‌­ها مایکوپلاسما را شناسایی می­کنند، یک سری واکنش­‌های شیمیایی را آغاز می­کنند و باعث تغییر رنگ قابل توجهی می­شوند. این روش دارای حساسیت بالاست اما مخصوص گونه­‌ها یا ژن­‌های زیادی نیستند.
• کیت‌های سنجش بیولومینسانس (Bioluminescence assay kit) که توسط شرکت‌های مختلف بیوتکنولوژی تولید می­شوند، کیت‌های تشخیص مایکوپلاسما مبتنی بر آنزیم هستند. این کیت­‌ها، آنزیم‌­های مایکوپلاسما را شناسایی می­کنند که توسط سلول‌­های یوکاریوتی (Eukaryotic cells) سنتز نمی‌­شوند. ابتدا مایکوپلاسما توسط اجزای کیت پاره می­شود، سپس با استفاده از آنزیم‌های خاصی، مکانیسم‌های سلولی ایجاد می­شود که منجر به تولید لومینسانس می­شود. سپس می­توان آلودگی را با یک لومینومتر تشخیص داد.
• برای تشخیص مایکوپلاسما می­‌توان رنگ­‌های غیر اختصاصی DNA را به محیط کشت آلوده اضافه کرد. با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت مشاهده می­‌شود که DNA مایکوپلاسما به صورت مجزا از DNA سلولی و به شکل خوشه­‌های کوچک ظاهر می­شود.
• رنگ‌آمیزی DNA فلورسنت (Fluorescent DNA staining) یکی دیگر از جایگزین‌های رنگ‌آمیزی DNA است. در این روش از رنگ­‌های DNA مانند DAPI و Hoechst 33258 برای رنگ آمیزی تمام DNA استفاده می­‌شود. مقداری تخصص در این فرآیند مورد نیاز است زیرا تفسیر نتیجه ممکن است دشوار باشد. چگالی کم مایکوپلاسماها، آلودگی توسط باکتری‌­های دیگر یا سیگنال­‌های فلورسنت خارج سلولی تولید شده توسط این باکتری‌­ها می‌­توانند مانع تفسیر صحیح نتایج شوند. همچنین سیگنال‌­های ناحیه هسته‌­ای، تشخیص مایکوپلاسما را دشوار می­کند.

پیشگیری از آلودگی مایکوپلاسما

بهترین و مهم­ترین راه برای پیشگیری از مایکوپلاسما، ارائه آموزش و راهنمایی مناسب به افراد شاغل در آزمایشگاه است. این کار را می‌­توان با آموزش کارکنان واجد شرایط برای فرآیند کشت سلولی انجام داد و با این کار یکی از علل آلودگی را از بین برد.

در صورت امکان باید یک آزمایشگاه جداگانه برای کشت سلولی و نگه­داری رده­‌های سلولی ایجاد شود. فراهم کردن چنین محیطی برای تجهیزات آزمایشگاهی نه تنها آلودگی مایکوپلاسما را کاهش می­دهد بلکه از سایر آلودگی­‌های باکتریایی و قارچی نیز جلوگیری می­کند.

• تجهیزات حفاظت فردی مناسب (Personal protective equipment (PPE))

از آنجایی که انسان­‌ها منبع اصلی آلودگی هستند، مراحل پیشگیری از شما شروع می­شود. اگر به اندازه کافی مراقب باشید که محیطی استریل برای کار فراهم کنید، خیلی زود قبل از این­که متوجه شوید، این امر به یک عادت تبدیل می‌شود. در این­جا چند کار برای انجام وجود دارد:

• در حین کار با خطوط سلولی از روپوش و ماسک آزمایشگاهی تمیز استفاده کنید.
• از گفتگو با سایر اعضای آزمایشگاه، عطسه یا سرفه در آزمایشگاه خودداری کنید. دهان انسان حاوی طیف گسترده­ای از مایکوپلاسماها است و این مایکوپلاسماها می‌توانند هنگام صحبت، خنده، عطسه یا سرفه وارد کشت سلولی شوند.
• هنگام کار از دستکش استفاده کنید و پس از استفاده آن را دور بیندازید. هنگامی که بدون دستکش یا ماسک کار می­کنید، تماس انسانی می‌تواند باعث ایجاد آلودگی شود. مطمئن شوید که دستکش‌ها و ماسک‌ها را به‌جای این­که در جیب‌های روپوش‌­های آزمایشگاهی خود قرار دهید، مرتباً تعویض کنید.
• برای جلوگیری از ورود آلاینده‌های محیطی، کفش جداگانه‌ای برای آزمایشگاه داشته باشید.

شکل 2: یک کارمند آزمایشگاه حین کار روی هود کشت بافت (Tissue culture hood) تجهیزات حفاظت فردی پوشیده است.

رده‌های سلولی و شناسا­گرها

• قبل از استفاده رده سلولی خود را از نظر آلودگی به مایکوپلاسما بررسی کنید.
• اطمینان حاصل کنید که هیچ گونه آلودگی در سرم مورد استفاده برای زیرکشت وجود ندارد. از به کار گیری محصولات تاریخ مصرف گذشته یا شناسا­گرهایی که برای مدت طولانی‌تری نگهداری شده‌­اند، خودداری کنید.
• تا حد امکان از ظروف تازه و آن­‌هایی که محکم مهر و موم و بسته­‌بندی شده‌­اند، استفاده کنید.
• برای جلوگیری از آلودگی متقاطع از پیپت‌­های یکبار مصرف استفاده کنید.
• اطمینان حاصل کنید که تمام تجهیزات و شناساگر­های مورد نیاز را قبل و در حین کار در محیطی که جریان هوای لامینار وجود دارد، نگه دارید.
• قبل از استفاده از رده­‌های سلولی برای آزمایش یا اهداف تحلیلی دیگر، بررسی­‌های معمولی را برای آلودگی مایکوپلاسما انجام دهید.
• به جای استفاده از فیلترهای ۰.۲ میکرونی برای فیلتراسیون محیط، از فیلترهای ۰.۱ میکرون استفاده کنید، زیرا راه بهتری برای جلوگیری از مایکوپلاسما می‌­باشد. هیچ اطمینان ۱۰۰٪ وجود ندارد که این فرآیند می­تواند از آلودگی جلوگیری کند، اما این کار یک عمل بسیار خوب برای پیشگیری از آلودگی است.
• مقدار کمی از ذخایر محیط کشت را برای آزمایش آماده کنید. زیرا این کار از آلودگی بقیه محیط جلوگیری می­کند.
• از قرار دادن طولانی مدت کشت سلولی در معرض هوا خودداری کنید و قبل از قرار دادن آن­ها در انکوباتور، درب بالن را محکم کنید. با این کار مشکل آلودگی از طریق آئروسل­‌ها حل می­شود.
• عمل کشت را بدون استفاده از آنتی­بیوتیک انجام دهید زیرا استفاده از آنتی­‌بیوتیک­‌ها می‌­تواند منجر به افزایش مقاومت مایکوپلاسما نسبت به آنتی­‌بیوتیک­‌ها شود. آنتی‌­بیوتیک‌­ها باید فقط برای از بین بردن مایکوپلاسماها استفاده شوند و نه برای جلوگیری از رشد آن‌­ها. همچنین استفاده طولانی مدت از یک آنتی­بیوتیک خاص می­تواند باعث مقاوم شدن سایر باکتری­‌ها به غیر از مایکوپلاسما شود.
• همیشه ذخایری به شکل ویال‌های منجمد شده از رده‌­های سلولی داشته باشید، حتی اگر زیست‌­پذیری سلول‌­های منجمد شده با هر زیرکشت کاهش یابد.

 

تجهیزات آزمایشگاهی

• دستگاه جریان هوای لامینار و تاسیسات آزمایشگاهی را به صورت دوره­ای ضد عفونی کنید.
• انکوباتورهای CO2 که برای حفظ رده­‌های سلولی استفاده می­شوند، نباید بیش از حد پر شوند (بیش از 60 درصد ظرفیت آن)، زیرا می­‌تواند باعث سرایت آلودگی مایکوپلاسما از یک رده سلولی به رده سلولی دیگر شود.
• چندین رده سلولی نباید در یک انکوباتور ذخیره شوند زیرا خطر آلودگی متقاطع را افزایش می­‌دهد.
• انکوباتورهای CO2باید به طور منظم تمیز شوند و از هر نوع رطوبتی باید اجتناب شود. آب مقطر تهیه شده برای حفظ رطوبت، باید به طور منظم تعویض شود زیرا مایکوپلاسماها، باکتری­‌ها و قارچ‌­ها می‌­توانند به این ظروف وارد شوند.
• هر محیط کشت ریخته شده را فوراً پاک کنید.
• حمام‌­های آب، ظروف نیتروژن مایع، بطری‌­های شناسا­گرها و سایر منابع عفونت باید به طور مرتب تمیز شوند و به طور دوره­ای از نظر آلودگی بررسی شوند.

 

حذف مایکوپلاسما پس از تشخیص

بعد از این که آلودگی مایکوپلاسما را پیدا کردید، چه باید کرد؟ بهترین راه دور انداختن فلاسک‌های کشت سلولی آلوده است. در مواردی که کشت‌­ها غیر قابل جایگزین کردن یا بسیار گران هستند، راه‌هایی برای حفظ آن­‌ها وجود دارد.  

شکل ۳: محیط کشت آلوده

حذف آلودگی یک فرآیند بسیار زمان­‌بر است و خطر سرایت آلودگی به سایر خطوط سلولی سالم را افزایش می­‌دهد. مواد حذف مایکوپلاسما (Mycoplasma Removal Agents (MRA)) مشتقاتی از خانواده آنتی‌بیوتیک‌های کینولون (quinolone) هستند و آنتی‌بیوتیک‌هایی با طیف وسیع هستند. از این مواد می­‌توان برای شستشوی کشت­‌های سلولی استفاده کرد.

بسته به شدت عفونت، فرایند حذف ممکن است از چند هفته تا چند ماه طول بکشد. پلاسموسین (Plasmocin) یک داروی پرمصرف است که می­‌تواند بیشتر مایکوپلاسماهای موجود در محیط کشت را از بین ببرد. همچنین داروهایی مانند BM Cyclin، fluoroquinolone ciprofloxacin، ciprobay، zagam، baytril،  tetracycline و غیره برای حذف مایکوپلاسما از کشت آلوده در دسترس هستند.

MRA­ها غیر سمی و موثر در زمینه از بین بردن بیشتر آلودگی‌­های مایکوپلاسما هستند، به راحتی قابل استفاده بوده و برای طیف وسیعی از مایکوپلاسما­ها موثر می‌­باشند. این روش­‌ها نمی­‌توانند حذف کامل مایکوپلاسما را تضمین کنند، اما می‌­توانند اکثر آلودگی­‌های مایکوپلاسماها را از بین ببرند و آخرین راه کمکی هستند.

در این فرایند معایبی نیز وجود دارد، زیرا طول مدت فرایند حذف می‌تواند بر رشد و بقای سلول تأثیر بگذارد. اگر مایکوپلاسماها آسیب دائمی به کشت سلولی وارد کرده باشند، غیر قابل جبران است. برخی از سلول‌ها ممکن است به دلیل دوره‌های انکوباسیون طولانی‌تر بمیرند و بر روی زنده ماندن کل سلول‌­ها تأثیر بگذارند.  

نتیجه گیری

به طور خلاصه، همیشه پیشگیری از آلودگی نسبت به این­که بعد از آلودگی آن را از بین ببریم، مهم‌­تر است. وقتی مایکوپلاسما کشت سلولی شما را آلوده می­کند نترسید، زیرا شما اولین فردی نیستید که با این مسئله مواجه می­شود. در صورت امکان به دیگران آموزش دهید و به آن­ها کمک کنید اهمیت پیشگیری از آلودگی را درک کنند.   از دوره‌ کارآموزی کشت سلولی ژنیران دیدن فرمایید:

دوره مهارت آموزی کشت سلول